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番木瓜果实expansin基因克隆及表达分析

作　者: 牛艳梅
导　师: 周鹏
学　校: 华南热带农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 番木瓜 expansin基因实时荧光定量PCR 基因表达分析果实成熟
分类号: S667.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
下　载: 236次
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内容摘要

番木瓜是一种典型的呼吸跃变型果实,对其进行成熟的调控及机理的研究具有重要的理论和实践意义。Expansin是一类存在于植物细胞壁上,并能快速缓冲张力,使植物细胞壁松驰的蛋白质。众多的研究资料表明,其在果实的成熟过程中起着重要的作用。近年来,关于果实中的expansin基因的研究越来越多,如香蕉、芒果和荔枝,但尚未见番木瓜expansin的研究报道。本研究提取成熟番木瓜果实的RNA,反转录合成cDNA,以cDNA为模板,根据已报道的expansin氨基酸保守序列设计简并引物进行RT-PCR,得到的扩增产物纯化后与pMD19-T载体连接,转化大肠杆菌,挑选阳性克隆进行序列测定,得到一个大小为531bp的基因片段,命名为Cp-EXP1,并登录Genbank,登录号为:DQ321829。经分析其编码177个氨基酸,具有expansin保守结构。通过与Genbank中其他expansin基因序列同源性比较发现,番木瓜Cp-EXP1与甜樱桃Exp1和酸樱桃Exp2的序列同源性最高,均为85.66%,与苹果Md-Exp1同源性为84.67%,与黄瓜Cs-EXP1同源性为79.92%。根据得到的Cp-EXP1基因保守片段设计引物,提取成熟番木瓜果实的RNA进行3’RACE,得到了长为673bp的Cp-EXP1基因3’端,与RT-PCR得到的保守片段拼接得到长度为710bp的序列,经Genscan分析后发现,得到的Cp-EXP1 3’端序列含有一个完整的阅读框,编码206个氨基酸。提取番木瓜不同组织的RNA,分别以expansin简并引物和管家基因引物进行RT-PCR,结果发现该基因在番木瓜的根、茎、叶、花、果实中均有表达。为了准确分析该基因在番木瓜果实中的作用,以不同成熟阶段的番木瓜果实总RNA为模板,进行荧光定量PCR。实验结果表明,Cp-EXP1基因在不同成熟阶段的番木瓜果实中的表达是有差异的,其表达水平受乙烯调控。首次在番木瓜中克隆expansin基因并进行表达分析,对expansin基因与乙烯的生成、果实成熟机理间关系的研究具有一定的理论指导意义,也为研究番木瓜果实的生长发育以及其品种的改良等打下了良好的基础。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-9
1 前言  9-26
  1.1 番木瓜概述  9-10
    1.1.1 生物学特性  9
    1.1.2 我国番木瓜生产状况  9-10
  1.2 果实成熟的生理学与分子生物学研究概述  10-13
    1.2.1 乙烯与果实成熟  10-11
    1.2.2 乙烯生物合成途径  11-12
    1.2.3 乙烯信号转导的研究进展  12-13
  1.3 番木瓜果实采后生理学及分子生物学研究现状  13-14
    1.3.1 番木瓜果实采后生理学的研究  13-14
  1.4 EXPANSIN 基因的研究进展  14-20
    1.4.1 Expansin 基因的发现及其结构  14-15
    1.4.2 Expansin 基因的作用机制  15-16
    1.4.3 Expansin 基因的基因家族  16-17
    1.4.4 Expansin 基因的功能  17-20
  1.5 荧光定量PCR 的研究进展  20-24
    1.5.1 荧光定量PCR 的原理  20-21
    1.5.2 荧光定量PCR 的特点  21
    1.5.3 实时荧光定量PCR 的荧光化学  21-23
    1.5.4 实时荧光定量PCR 的定量方法  23
    1.5.5 实时荧光定量PCR 的应用  23-24
  1.6 本研究的目的和意义  24-25
  1.7 技术路线  25-26
2 材料与方法  26-35
  2.1 实验材料、试剂及仪器  26-27
    2.1.1 材料及处理  26
    2.1.2 实验试剂  26
    2.1.3 实验仪器  26-27
  2.2 实验方法  27-35
    2.2.1 基因克隆  27-31
    2.2.2 3’RACE  31-32
    2.2.3 RT-PCR 进行组织表达特异性分析  32-33
    2.2.4 实时荧光定量PCR 进行表达分析  33-35
3 结果与分析  35-46
  3.1 EXPANSIN 基因的克隆  35-38
    3.1.1 PCR 扩增  35-36
    3.1.2 序列测定及分析  36-38
  3.2 3’RACE  38-40
  3.3 RT-PCR 进行组织表达特异性分析  40-41
  3.4 实时定量PCR 进行表达分析  41-46
    3.4.1 RNA 的提取  41-42
    3.4.2 目的基因的标准曲线的制备  42-43
    3.4.3 管家基因的标准曲线的制备  43-44
    3.4.4 Cp-EXP1 基因在番木瓜果实成熟阶段中的表达水平分析  44-46
4 讨论  46-49
  4.1 关于所用的实验方法  46-48
    4.1.1 有关番木瓜RNA 的提取  46
    4.1.2 关于实时荧光定量PCR  46-48
  4.2 关于序列分析  48
  4.3 CP-EXP 1 的表达与乙烯的关系  48-49
5 结论  49-50
参考文献  50-55
缩写词（ABBREVIATION）  55-57
致谢  57

番木瓜果实expansin基因克隆及表达分析

内容摘要

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