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蚕蛹蛋白ACE抑制肽的制备及其理化性质研究

作　者: 徐金玲
导　师: 吴琼英
学　校: 江苏科技大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 蚕蛹蛋白酶解 ACE抑制活性分离纯化结构分析
分类号: S886.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

蚕蛹是蚕茧缫丝的副产物,由于色泽与口感较差,因而限制了它在食品和药品工业中的应用。本文旨在利用酶法制备蚕蛹蛋白ACE(血管紧张素转化酶)抑制肽,以扩大其生产应用范围。通过SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)、氨基酸组成分析、DSC(差示扫描量热仪分析)等方法研究了蚕蛹蛋白及其分离蛋白组分的理化性质;以酶解产物的ACE抑制活性为评价指标,采用响应曲面法对酶法制备蚕蛹蛋白ACE抑制肽的工艺进行了优化;并采用超滤、DEAE-52和Sephadex G -50柱层析等方法对蚕蛹蛋白ACE抑制肽进行了分离纯化,初步探讨了蚕蛹蛋白ACE抑制肽对ACE的作用机制。干蚕蛹中,粗蛋白的含量为57.61 %,其中,水溶性蛋白和碱溶性蛋白是蚕蛹主要的蛋白组分。蚕蛹水溶性蛋白和碱溶性蛋白的氨基酸种类齐全,且必需氨基酸占总氨基酸的质量分数分别为41.24 %和39.16 %,明显高于WHO推荐的氨基酸组成模式(>36 %);蚕蛹水溶性蛋白有2次热变性过程,起始变性温度分别为45.98℃和88.87℃,蚕蛹碱溶性蛋白有1次热变性过程,其变性起始温度为180.37℃。蚕蛹水溶性蛋白和碱溶性蛋白的Alcalase酶解产物均具有较强的ACE抑制活性,IC50(半抑制浓度)分别为0.121和0.113 mg/mL。以酶解产物对ACE的抑制率为评价指标,从Alcalase、α-胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶中筛选出Alcalase做为蚕蛹蛋白制备ACE抑制肽的水解用酶,并采用响应面试验设计方法对酶法制备蚕蛹蛋白ACE抑制肽的工艺进行优化。确定最优工艺参数为:pH 9.0、酶解温度50.8℃、加酶量3500 U/g;在此条件下,得到的蚕蛹蛋白酶解产物对ACE的IC50值为0.102 mg/mL。蚕蛹蛋白酶解产物经超滤分离后,ACE抑制活性最强的是MW(分子量)<5 kDa组分,其次依次为5～10 kDa组分和MW>10 kDa组分。利用Lineweaver-Burk方程发现MW<5 kDa组分对ACE呈现一种竞争性抑制关系;此外,紫外光谱分析表明MW<5 kDa组分能够改变ACE的结构。蚕蛹蛋白ACE抑制肽的性能试验表明,蚕蛹蛋白ACE抑制肽具有良好的酸、热稳定性和抗肠道酶消化能力。蚕蛹蛋白ACE抑制肽经DEAE-52柱层析和Sephadex G -50柱层析纯化后,其活性得到极大的提高,它的IC50值为0.072 mg/mL,分子量分布为226.34～983.61 Da,由2～8肽组成,其中,分子量为474.63 Da的肽链是主要的活性成分。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-15
第1章绪论  15-25
  1.1 高血压定义及其分类  15
  1.2 血管紧张素转化酶在血压调节中的作用  15-17
    1.2.1 血管紧张素转化酶  15-16
    1.2.2 ACE 在血压调节中的作用  16-17
    1.2.3 高血压病的治疗  17
  1.3 食源性ACE 抑制肽研究进展  17-21
    1.3.1 乳源类蛋白  17-18
    1.3.2 植物类蛋白  18-19
    1.3.3 水产类蛋白  19-20
    1.3.4 其他类蛋白  20-21
  1.4 ACE 抑制肽的构效关系  21-22
  1.5 蚕蛹利用现状  22
  1.6 立题背景及意义  22-23
  1.7 本研究的主要内容和技术路线  23-25
    1.7.1 主要研究内容  23-24
    1.7.2 研究技术路线  24-25
第2章蚕蛹分离蛋白的理化性质及其产物ACE 抑制活性研究  25-37
  2.1 前言  25
  2.2 材料与设备  25-26
    2.2.1 主要材料与试剂  25
    2.2.2 主要仪器与设备  25-26
  2.3 试验方法  26-29
    2.3.1 蚕蛹蛋白分离物质提取及含量分析  26-27
    2.3.2 蚕蛹分离蛋白的氨基酸分析  27-28
    2.3.3 蚕蛹分离蛋白的差示扫描量热分析  28
    2.3.4 蚕蛹分离蛋白酶解产物的ACE 抑制活性分析  28-29
  2.4 结果与讨论  29-35
    2.4.1 蚕蛹基本组成测定  29
    2.4.2 蚕蛹不同蛋白组分含量测定  29-30
    2.4.3 蚕蛹分离蛋白的SDS-PAGE 结果  30
    2.4.4 蚕蛹分离蛋白的氨基酸组成分析  30-33
    2.4.5 蚕蛹分离蛋白的差示扫描量热仪分析结果  33-35
    2.4.6 蚕蛹分离蛋白的ACE 抑制活性比较  35
  2.5 本章小结  35-37
第3章酶法制备蚕蛹ACE 抑制肽水解用酶筛选及水解条件优化  37-51
  3.1 前言  37
  3.2 材料与设备  37-38
    3.2.1 主要材料与试剂  37-38
    3.2.2 主要仪器与设备  38
  3.3 试验方法  38-40
    3.3.1 蚕蛹蛋白酶解试验  38
    3.3.2 蛋白质水解度分析  38-39
    3.3.3 RP-HPLC 分析  39
    3.3.4 Sephadex G-50 分析  39
    3.3.5 ACE 抑制肽活性的体外检测方法  39
    3.3.6 ACE 抑制肽得率的测定  39
    3.3.7 单因素试验和响应面法  39-40
  3.4 结果与讨论  40-50
    3.4.1 酶法制备蚕蛹ACE 抑制肽水解用酶的筛选  40-43
    3.4.2 Alcalase 水解蚕蛹蛋白的条件优化  43-50
  3.5 本章小结  50-51
第4章蚕蛹ACE 抑制肽的超滤分离及其性质研究  51-61
  4.1 前言  51
  4.2 材料与设备  51-52
    4.2.1 主要材料与试剂  51
    4.2.2 主要仪器与设备  51-52
  4.3 试验方法  52-53
    4.3.1 超滤原液制备  52
    4.3.2 超滤分离  52
    4.3.3 RP-HPLC 分析  52
    4.3.4 ACE 抑制活性的体外检测  52
    4.3.5 ACE 抑制肽得率的测定  52
    4.3.6 ACE 抑制肽稳定性试验  52-53
    4.3.7 ACE 抑制肽对ACE 影响的紫外光谱  53
  4.4 结果与讨论  53-60
    4.4.1 超滤对ACE 抑制活性的影响  53-55
    4.4.2 MW  55-57
    4.4.3 MW  57-60
  4.5 本章小结  60-61
第5章 DEAE-52 及Sephadex G-50柱层析对蚕蛹ACE抑制肽的分离纯化及结构表征  61-73
  5.1 前言  61
  5.2 材料与设备  61-62
    5.2.1 主要材料与试剂  61-62
    5.2.2 主要仪器与设备  62
  5.3 试验方法  62-64
    5.3.1 蚕蛹蛋白超滤液的制备  62
    5.3.2 DEAE-52 柱层析  62-63
    5.3.3 液-质联用  63-64
    5.3.4 Sephadex G-50 分析  64
    5.3.5 ACE 抑制活性的体外检测  64
  5.4 结果与讨论  64-71
    5.4.1 DEAE-52 树脂分离蚕蛹 ACE 抑制肽  64-66
    5.4.2 凝胶层析分离蚕蛹 ACE 抑制肽  66-67
    5.4.3 液-质联用一级质谱分析  67-71
  5.5 本章小结  71-73
结论  73-75
参考文献  75-83
攻读学位期间发表的学术论文  83-85
致谢  85-86
详细摘要  86-90

蚕蛹蛋白ACE抑制肽的制备及其理化性质研究

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