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产偏酸性蛋白酶菌株的筛选及其酶应用特性的研究

作　者: 戚淑威
导　师: 黄遵锡
学　校: 云南师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 烟曲霉偏酸性蛋白酶发酵条件优化酶学性质 rDNA-ITS区序列分析啤酒澄清
分类号: TQ920.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

酸性蛋白酶是一种能在酸性环境下水解蛋白质的酶类，其最适作用pH值为2.5-5.0。由于酸性蛋白酶具有较好的耐酸性，因此被广泛地应用于食品、医药、轻工、皮革工艺以及饲料加工工业中。目前用于工业化生产的酸性蛋白酶大多为霉菌酸性蛋白酶，此类酶的最适作用pH值为3.0左右，当pH值升高时，酸性蛋白酶的酶活会明显降低，且此类酶不耐热，当温度达到50℃以上时很不稳定，从而限制了酸性蛋白酶的应用范围。因此，本研究以开发耐温偏酸性蛋白酶为目标，进行了以下几方面的研究：（1）偏酸性蛋白酶产生菌的分离筛选。（2）偏酸性蛋白酶粗酶酶学性质的研究。（3）偏酸性蛋白酶固体发酵条件的优化。（4）偏酸性蛋白酶产生菌P-1007的初步鉴定。（5）偏酸性蛋白酶在啤酒澄清中的应用。本论文主要研究结果和结论如下：（1）用常规土壤分离方法，从土壤样品中筛选到一株产偏酸性蛋白酶的菌株，命名为P-1007。（2）通过单因素发酵条件实验和正交实验的方法得到最佳固体发酵条件为：麦麸15g，黄豆粉8％，葡萄糖3％，Na₂PO₄ 1％，CuSO₄ 0.2％，水35ml，最佳起始pH7.0，最适发酵温度为40℃。在此条件下所产酶活可达3700u／g，比原始菌株发酵酶活提高了将近2倍，且产酶稳定性较好。（3）菌株P-1007所产的偏酸性蛋白酶的最适作用pH值为5.5，最适作用温度为50℃。酶的pH稳定性和耐温性较好，50℃、pH5.5条件下保温8h后剩余酶活可达83％以上，pH5.5、50℃条件下保温2h后剩余酶活仍在70％以上。Mn²⁺、Cu^*2+)对偏酸性蛋白酶有明显的激活作用，其它金属离子则对该酶有不同程度的抑制作用。与目前所得到的酸性蛋白酶相比较，偏酸性蛋白酶具有较高的作用pH值和较好的耐温性。

全文目录

摘要  8-10
ABSTRACT  10-13
第一章绪论  13-26
  1 酸性蛋白酶的来源  13
  2 酸性蛋白酶的研究现状  13-19
    2.1 酸性蛋白酶的理化性质  13-15
      2.1.1 生物学性质  13-14
      2.1.2 酶学性质  14-15
        2.1.2.1 酸性蛋白酶的pH适应性  14
        2.1.2.2 酸性蛋白酶的温度适应性  14-15
        2.1.2.3 酸性蛋白酶的抑制剂  15
    2.2 酸性蛋白酶的分类  15-16
    2.3 酸性蛋白酶的作用机理  16
    2.4 产酸性蛋白酶微生物的筛选  16-17
      2.4.1 筛选培养基的制备  16-17
      2.4.2 酸性蛋白酶产生菌的筛选方法  17
    2.5 影响酸性蛋白酶产量的因素  17
    2.6 酸性蛋白酶产生菌的育种  17-19
      2.6.1 通过传统的诱变技术筛选高产菌株  17-18
      2.6.2 通过优化发酵条件来提高产酶量  18-19
  3 酸性蛋白酶的生产制备  19-20
    3.1 发酵  19-20
    3.2 酶制剂的制备  20
  4 酸性蛋白酶的分离纯化  20-21
  5 菌种鉴定  21-22
    5.1 核糖体rDNA的结构及其特点  21
    5.2 核糖体rDNA-ITS序列分析  21-22
  6 酸性蛋白酶的应用  22-24
    6.1 酸性蛋白酶在皮革工业中的应用  22-23
      6.1.1 皮革软化  22
      6.1.2 羊毛细化  22
      6.1.3 预处理羊毛低温染色  22-23
    6.2 酸性蛋白酶在食品工业中的应用  23-24
      6.2.1 用于酒类酿造  23
        6.2.1.1 啤酒酿造  23
        6.2.1.2 白酒酿造  23
      6.2.2 用于酱油酿造  23-24
      6.2.3 用于食醋生产  24
    6.3 酸性蛋白酶在畜牧业中的应用  24
    6.4 酸性蛋白酶在医疗方面的应用  24
    6.5 酸性蛋白酶的其它用途  24
  7 本课题的研究目的和意义  24-25
  8 研究内容  25-26
第二章偏酸性蛋白酶产生菌的分离筛选  26-32
  1 材料和方法  26-30
  2 结果与分析  30-31
    2.1 菌种的筛选  30-31
      2.1.1 初筛  30
      2.1.2 复筛  30-31
        2.1.2.1 透明圈测定法  30
        2.1.2.2 Folin-酚试剂显色法测酶活  30-31
  3 小结  31-32
第三章 P-1007产偏酸性蛋白酶的酶学性质及其固体发酵条件的研究  32-45
  1 材料和方法  32-34
  2 结果与分析  34-44
    2.1 酶学性质的研究  34-37
      2.1.1 酶的最适作用pH值  34
      2.1.2 酶的最适作用温度  34-35
      2.1.3 酶的pH稳定性  35-36
      2.1.4 酶的耐温性  36
      2.1.5 金属离子对酶活力的影响  36-37
    2.2 固体发酵条件的优化  37-44
      2.2.1 不同氮源对产酶的影响  37
      2.2.2 不同碳源对产酶的影响  37-38
      2.2.3 不同磷酸盐对产酶的影响  38
      2.2.4 不同金属盐类对产酶的影响  38-39
      2.2.5 不同含水量对产酶的影响  39
      2.2.6 发酵温度对产酶的影响  39-40
      2.2.7 不同起始pH对产酶的影响  40
      2.2.8 单因素发酵条件的进一步优化和验证  40-42
        2.2.8.1 不同含量黄豆粉对产酶的影响  40-41
        2.2.8.2 不同含量葡萄糖对产酶的影响  41
        2.2.8.3 不同含量的NaH_2PO_4对产酶的影响  41-42
        2.2.8.4 不同含量的CuSO_4对产酶的影响  42
      2.2.9 最佳发酵条件的验证  42-43
      2.2.10 菌株产酶稳定性的研究  43-44
  3 小结  44-45
第四章产偏酸性蛋白酶菌株的鉴定及其系统发育分析  45-55
  1 材料和方法  45-48
  2 结果与分析  48-53
    2.1 菌种的显微观察及其鉴定  48-51
    2.2 菌种生长状况  51
    2.3 总DNA的提取  51
    2.4 PCR扩增产物  51-52
    2.5 rDNA-ITS区序列分析  52-53
    2.6 系统发育树的构建  53
  3 小结  53-55
第五章偏酸性蛋白酶在啤酒澄清中的应用试验  55-70
  1 材料和方法  55-60
  2 结果与分析  60-68
    2.1 酪氨酸含量的变化  60
    2.2 透光率的变化  60-61
    2.3 总氮量的变化  61
    2.4 可凝固性氮量的变化  61-62
    2.5 a-氨基氮含量的变化  62-63
    2.6 pH值的变化  63
    2.7 泡持性的变化  63-64
    2.8 与酿造复合酶、啤酒用中性蛋白酶应用效果的比较  64-68
      2.8.1 最适作用pH值与最适作用温度的比较  64-67
      2.8.2 酪氨酸含量、吸光度、总氮量、可凝固性氮含量、a-氨基氮含量、pH值变化的比较  67-68
      2.8.3 泡持性的比较  68
  3 小结  68-70
第六章总结  70-74
  1 总结  70-72
  2 创新  72
  3 建议  72-74
参考文献  74-78
致谢  78-79
附录1  79-80
附录2  80-83
附录3  83-84

产偏酸性蛋白酶菌株的筛选及其酶应用特性的研究

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