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重组多功能抗凝多肽基因的大肠杆菌中的表达及活性测定

作　者: 穆瑞斌
导　师: 秦永文
学　校: 第二军医大学
专　业: 心血管内科学
关键词: 融合蛋白抗血小板抗凝血酶 GST 水蛭素。
分类号: R54
类　型: 硕士论文
年　份: 2002年
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内容摘要

在由于血管成形术或动脉粥样斑块破裂及其它损伤因素所致血管壁损伤而引起的血栓形成过程中，血小板、纤维蛋白原和凝血酶起着非常关键的作用。目前防止血栓形成和发展的方法包括抑制血小板的活化、抑制凝血酶的活性、或者是增强纤溶系统的活性。本实验通过基因工程的方法，人工合成一种能同时表达抗血小板和抗凝血酶的多功能杂交分子，并在体外实验中观察其抗血小板和抗凝血酶的活性，为抗栓药物的研制提供一个新的方向。本实验分为三个部分：（一）含多功能抗凝多肽基因片段的表达载体的构建：重组多功能抗凝多肽分子，它由谷胱甘肽－S－转移酶（GST）通过一可被Xa裂解的序列和重组抗凝多肽结合而形成。重组抗凝多肽含有31个氨基酸，由三个功能部分组成：（1）Lys-Gly-Asp(KGD)氨基酸序列，可抑制血小板GpⅡb／Ⅲa受体和纤维蛋白原的结合；（2）纤维蛋白单肽A的7－16残基（FBA7－16），它是凝血酶的抑制剂。（3）水蛭素C末端的12肽，它可直接抑制凝血酶。编码重组抗凝多肽的DNA序列是根据欲合成的氨基酸序列逆向翻译后经人工合成，编码重组抗凝多肽的目的基因共有115bp，其中包括两侧的BamHⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶的识别位点，此115个bp分成两个引物由上海生工公司的DNA合成仪合成（2OD），以上两套引物中有25个碱基互补，其互补之外的空缺部分通过PCR扩增补平得到两条互补的DNA双链。取样品用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行鉴定，可见一条清晰的条带，片段大小稍大于100bp。（二）多功能抗凝多肽基因表达载体的构建及表达将将纯化的目的基因DNA片段插入质粒pUC18的BamHⅠ和EcoRⅠ之间构成克隆质粒，并转染E.coli DH5α后进行培养用于质粒的扩增，抽提质粒后用DNA序列仪对其进行测序，测序结果表明，其核苷酸序列完全正确。将纯化的目的基因DNA片段插入表达质粒pGEX-5X-3多克隆位点的BamHⅠ和EcoRⅠ之间，与其中的编码GST序列的3′端相连接融合，构建重组质粒，转染E.coli DH5α构建阳性菌株。另外，也将不含目的基因的pGEX-5X-3转染E.coli DH5α用于对照研究。将转染后的菌株于含氨苄青霉素的LB培养液中进行培养，并加入IPTG进行诱导，将诱导后收集的细菌在冰浴中超声破菌后，取上清液用谷胱甘肽－琼脂糖珠悬液进行抽提纯化，得到纯化的融合蛋白。不含目的基因的转染菌表达的则为GST。应用SDS－<WP=6>PAGE电泳分别对该菌株的表达产物及应用亲和层析方法纯化后的产物进行鉴定，纯化后的融合蛋白的电泳条带，其大小约为30KD，纯度大于95%，较GST约大3KD。（三）含多功能抗凝多肽的融合蛋白活性的测定1 抗凝血酶活性的测定抽取8名健康志愿者血液(在2周内内未用过任何抗凝或对血凝系统有影响的药物，每个活性部分均重复测定3次，取其平均值)，通过测定部分凝血活酶时间（aPTT）和凝血酶时间（TT）来测定样品的抗凝血酶活性；抗凝血酶的蛋白分解活性的测定则应用生色底物（Chromozym TH）。同时测定等摩尔浓度的GST、水蛭素54－65和纤维蛋白单肽A作为对照。结果表明，GST和纤维蛋白单肽A对aPTT、TT均无延长作用，对凝血酶无抑制作用；水蛭素54－65则对aPTT、TT有一定的延长作用，而对凝血酶的蛋白分解活性则无抑制作用；而抗凝多肽则对aPTT、TT有显著延长作用，小剂量的融合蛋白就能对凝血酶的蛋白分解活性有显著抑制作用，随浓度的增加而增加。这表明其对凝血酶有明显的抑制作用，且其作用明显强于水蛭素54－65。2 抗血小板活性的测定用低温离心机（SORVALL RC 5C Plus）制备富含血小板的血浆（PRP），用比浊法在血液凝聚仪上测定在室温下加入ADP后4分钟内的血小板聚集率（以%表示）。结果表明融合蛋白对血小板聚集有明显的抑制效应，稍弱于RGD，同时也发现GST对血小板聚集有抑制效应，但要明显弱于融合蛋白。而水蛭素54－65和纤维蛋白单肽A则对血小板聚集无影响。本研究发现：（1）大肠杆菌中能够表达出较高产量的融合蛋白，且具有可溶性。（2）融合蛋白使aPTT、TT明显延长及凝血酶蛋白水解酶活性受到抑制。其抗凝血酶作用明显强于水蛭素的C未端12肽及FBA。表明二者发挥抗凝血酶的协同作用。（3）体外血小板聚集抑制作用融合蛋白强于GST，显示融合蛋白中GST与KGD序列具有协同抗血小板作用。（4）融合蛋白、KGD均能通过占据GPIIb/IIIa 受体而抑制血小板聚集。（5）GST对血小板的聚集也有轻至中度的抑制作用。本研究发现GST抑制血小板聚集还通过拮抗GPIIb/IIIa 受体的途径。总之，在本实验中我们通过基因重组的方法构建了一个能够在大肠杆菌中表达的杂交肽，它能够同时具有抗凝血酶和抗血小板作用。结果表明通过基因重组的方法设计一具复合抗凝功能的多肽是可行的。

全文目录

附录  4-5
中文摘要  5-7
英文摘要  7-10
前言  10-12
第一部分含多功能抗凝多肽基因表达载体的构建  12-24
  材料  12-15
  方法  15-20
  结果  20-22
  讨论  22-24
第二部分多功能抗凝多肽的表达及纯化  24-29
  材料  24
  方法  24-26
  结果  26-27
  讨论  27-29
第三部分含多功能抗凝多肽的融合蛋白活性的测定  29-36
  材料  29
  方法  29-30
  结果  30-33
  讨论  33-36
小结  36-37
参考文献  37-40
致谢  40-41
文献综述  41-45

重组多功能抗凝多肽基因的大肠杆菌中的表达及活性测定

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