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大豆异黄酮糖苷水解酶的分离纯化及性质研究

作　者: 宋明
导　师: 谢明杰
学　校: 辽宁师范大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 大豆异黄酮糖苷水解酶纯化性质 Absidia sP.R菌株
分类号: Q814
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

Absidia sp．R菌是从酒曲中分离得到的一种霉菌，该菌在适宜条件下能够产生高活性的大豆异黄酮糖苷水解酶。本文围绕大豆异黄酮糖苷水解酶的分离纯化以及理化性质等展开系列研究。大豆异黄酮糖苷水解酶经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Cellocuse（DE-52）离子交换凝胶层析对发酵液进行了分离和纯化，并得到了电泳纯的酶。该酶被纯化了11倍，收率为10.9％；该酶的最适反应温度为50℃；最适pH为5.0；温度在60℃以下、pH为5.0-7.0范围内该酶较稳定，超过此范围，酶活力明显降低；Co²⁺对该酶有激活作用；Ag⁺、Cu²⁺对该酶有抑制作用；经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得该酶的分子量为53kD。等电聚焦电泳测得大豆异黄酮糖苷水解酶等电点为3.2；以染料木甙为底物，pH为5.0，反应温度为50℃时的米氏常数（Km）为12.89mmol／L。该酶在水解底物的特性上不同于传统的β-葡萄糖苷酶（EC3.2.1.21），用大豆异黄酮糖苷酶将提取的大豆异黄酮进行酶解，得到游离型的苷元。此酶的获得以及对其性质的研究对今后开发富含大豆异黄酮甙元的保健食品具有重要的意义和参考价值。

全文目录

中文摘要  6-7
1 文献综述  7-23
  1.1 大豆异黄酮的来源、组成和结构  7-9
  1.2 大豆异黄酮的吸收与代谢  9-10
  1.3 大豆异黄酮的性质  10-11
    1.3.1 显色  10
    1.3.2 旋光性  10
    1.3.3 溶解性  10
    1.3.4 酸碱性  10
    1.3.5 还原性  10-11
  1.4 大豆异黄酮的生理作用  11-14
    1.4.1 抗肿瘤作用  11-12
    1.4.2 心血管的防护作用  12
    1.4.3 预防骨质疏松作用  12-13
    1.4.4 弱雌激素和抗雌激素作用  13
    1.4.5 抗菌消炎作用  13-14
    1.4.6 提高机体免疫力作用  14
  1.5 酶学研究的基本方法  14-21
    1.5.1 酶的分类  14-15
    1.5.2 β-葡萄糖苷酶  15-16
    1.5.3 酶蛋白分离纯化的基本方法  16-21
      1.5.3.1 酶蛋白分离纯化操作步骤  16-17
      1.5.3.2 酶分离纯化过程中常用的技术及其基本原理  17-20
      1.5.3.3 酶分离纯化过程中常用的分析方法  20-21
  1.6 改变大豆异黄酮糖基提高其活性的研究进展  21-23
    1.6.1 大豆异黄酮甙的糖链与其生物活性的关系  21
    1.6.2 改变大豆异黄酮糖基提高其生物活性的研究进展  21-22
    1.6.3 微生物酶水解大豆异黄酮的意义  22-23
2 材料与方法  23-32
  2.1 材料与仪器  23-25
  2.2 实验方法  25-32
    2.2.1 粗酶液的获得  25-26
    2.2.2 酶活力测定方法  26
    2.2.3 硫酸铵分级沉淀  26-27
    2.2.4 DEAE-Cellocuse DE-52离子交换层析  27
      2.2.4.1 装柱  27
      2.2.4.2 DE-52柱预处理  27
      2.2.4.3 梯度洗脱  27
    2.2.5 提纯酶液的制备  27
    2.2.6 提纯酶的性质研究  27-30
      2.2.6.1 酶蛋白纯度测定方法  27-29
      2.2.6.2 提纯酶对不同底物水解方法的测定  29-30
    2.2.7 酶解反应条件的测定  30-32
      2.2.7.1 酶反应底物浓度的确定  30
      2.2.7.2 酶催化反应最适温度的测定  30-31
      2.2.7.3 酶温度稳定性的测定  31
      2.2.7.4 酶催化最适pH的测定  31
      2.2.7.5 酶pH稳定性的测定  31
      2.2.7.6 金属离子对酶活力影响的测定  31
      2.2.7.7 酶分子量的测定  31
      2.2.7.8 等电点(pI)的测定  31-32
      2.2.7.9 建立米氏方程的方法  32
    2.2.8 酶解产物的测定与分离  32
      2.2.8.1 酶解产物的测定：HPLC法  32
      2.2.8.2 酶解产物的分离方法：采用硅胶柱分离法  32
3 结果与讨论  32-49
  3.1 大豆异黄酮糖苷水解酶的分离纯化  32-36
    3.1.1 无机盐种类的确定  33
    3.1.2 最佳硫酸铵饱和度的选择  33-34
    3.1.3 DEAE-Cellocuse DE-52离子交换层析分离纯化混合酶  34-36
  3.2 大豆异黄酮糖苷水解酶的性质  36-45
    3.2.1 提纯酶对不同底物的水解结果  36
    3.2.2 纯酶分子量的测定  36-38
    3.2.3 酶解反应底物浓度的确定  38
    3.2.4 酶反应最适温度  38-39
    3.2.5 提纯酶的温度稳定性  39-40
    3.2.6 酶反应最适pH  40-41
    3.2.7 pH稳定性  41-42
    3.2.8 金属离子对酶活力的影响  42-43
    3.2.9 大豆异黄酮糖基水解酶等电点的测定  43
    3.2.10 大豆异黄酮糖基水解酶催化反应动力学方程  43-45
  3.3 酶法大量制备大豆异黄酮甙元  45-49
    3.3.1 大豆异黄酮的酶法水解  45-48
    3.3.2 酶解产物的分离纯化  48-49
4 结论与展望  49-51
  4.1 研究结论  49
  4.2 研究的创新点  49-50
  4.3 本研究有待深入的内容  50
  4.4 展望  50-51
Abstract  51-52
参考文献  52-57
致谢  57-58
学位论文独创性声明  58
学位论文版权的使用授权书  58

大豆异黄酮糖苷水解酶的分离纯化及性质研究

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