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叶绿体基因编码蛋白的体外翻译系统构筑

作　者: 孙峰
导　师: 张立新
学　校: 兰州大学
专　业: 植物分子生物学
关键词: 叶绿体基因编码蛋白定向克隆截断片段基因体外转录体外翻译
分类号: Q943
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

以高等植物豌豆和烟草叶绿体基因编码的蛋白D1,细胞色素f和细胞色素b₆为研究对象,采用分子生物学基因克隆,体外转录,蛋白质放射自显影分析技术,构建具有翻译活性的同源叶绿体体外翻译系统,以系统深入地研究叶绿体基因编码蛋白的类囊体膜插入合成组装调控的分子机制。所得结果摘要如下: （1）以完整的叶绿体DNA为模板,采用定向克隆策略,构建了具有高保真性能的叶绿体基因编码光系统蛋白D1,Cyt f和Cytb₆全长基因psbA,petA,petB。采用嵌套PCR方法体外连接烟草psbA 85bp翻译强启动子和petB全长基因,构建至体外转录载体pBluescript Ⅱ SK/KS（+/-）上;设计双酶切位点引物,克隆了D1（5跨膜区）和Cytb₆（4跨膜区）不同跨膜区截断片段基因（10种）,新引入5’overhangs酶切位点消除了体外转录中的3’overhangs,避免了多转录物的产生。这为系统研究叶绿体基因编码蛋白何时何阶段稳定插入类囊体膜并组装成功能复合物提供了研究平台。（2）构建了稳定的,高产,特异的体外转录系统。通过延长蛋白酶K消化时间,增加震荡次数,简化纯化步骤,降低了RNase污染转录体系的几率;向目的基因末端统一引入5’overhangs（Hind Ⅲ）的酶切位点,使得特异性地转录目的基因mRNA成为可能。对10种基因片段的体外转录实验显示,mRNA转录物产量从2.5-11.6mg/ml之间(纯度oD_260/280=1.75-1.85之间)。可作为外源添加的mRNA转录物来源,用于之后的体外翻译体系。（3）制备出具有体外翻译活性的豌豆叶绿体30,000g基质上清（S30）提取液,通过大量种植高代谢活性,低核酸降解活性的幼龄期豌豆,Pcrcoll梯度方法提取完整的叶绿体,缩短提取S30时间,添加蛋白酶抑制剂等保护物质,有效提高S30蛋白质浓度（16-25mg/ml）,获得一批具有很强翻译活性的S30提取液,体外翻译实验显示利用该S30提取液,翻译出含Cytb₆第一跨膜区（包含烟草psbA的启动子）的多肽蛋白。证实该系统具有翻译外源基因的能力。

全文目录

中文摘要  5-6
英文摘要  6-8
缩写及中英文对照  8-10
前言叶绿体基因编码蛋白的翻译和类囊体膜插入组装研究进展  10-30
材料和方法  30-36
  完整的叶绿体提取  30-31
  体外翻译基质S30fractions提取液的制备  31
  叶绿体DNA提取  31-32
  叶绿体编码基因不同截断片段的构建  32-33
  体外转录  33-35
  体外翻译  35-36
实验结果  36-46
  1.幼龄期豌豆的种植  36-37
  2.豌豆完整的叶绿体提取  37
  3.体外翻译基质提取液S30的制备  37-38
  4.叶绿体编码基因的分子克隆  38-42
  5.叶绿体编码基因的体外转录  42-44
  6.叶绿体编码基因的体外翻译  44-46
实验讨论  46-50
  1.完整的叶绿体基因组DNA提取  46
  2.叶绿体编码基因的分子克隆  46-47
  3.同源叶绿体体外翻译系统构筑  47-50
参考文献  50-62
致谢  62

叶绿体基因编码蛋白的体外翻译系统构筑

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