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猪瘟病毒C-株全长cDNA感染性的恢复及其标记疫苗的构建
作 者: 张淼涛
导 师: 张彦明;谢庆阁
学 校: 西北农林科技大学
专 业: 临床兽医学
关键词: CSFV C-株 全长cDNA 基因重组 体外转录 转染 感染性 猪繁殖与呼吸综合征 标记疫苗
分类号: S852.5
类 型: 博士论文
年 份: 2005年
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内容摘要
猪瘟是危害养猪业的重要疾病之一。猪瘟病毒(CSFV)C-株是世界范围内公认的免疫性能良好的弱毒疫苗株。为探讨CSFV C-株组织毒在SK-6 细胞上的嗜性及其检测方法,以CSFV C-株兔脾组织毒为对象,以SK-6 细胞作为病毒宿主,借助直接荧光抗体染色、夹心ELISA 和RT-PCR 等方法研究了病毒抗原的表达并检测了病毒核酸序列,结果表明,C-株兔脾组织毒可在SK-6 细胞中低水平增殖和表达。ELISA 法和RT-PCR 法适于检测CSFV 弱毒疫苗株,但直接荧光抗体染色法不宜用于CSFV 弱毒疫苗株的检测。该研究为CSFV 弱毒疫苗株的检测提供了一定指导,为C-株兔脾组织毒在SK-6 细胞中的增殖培养奠定了基础,也为CSFV 的逆向遗传学研究提供了基础条件。经过测序发现本研究室前期构建的CSFV 全长cDNA 分子中存在几个致死性突变位点,致使该cDNA 缺乏感染性,为了恢复其感染性,采用RT-PCR、Nested PCR 和Half-nested PCR 技术从实验感染兔脾组织的总RNA 中得到了CSFV C-株全长cDNA 的3 个待改造片段,分别克隆于pMD18-T 载体后进行测序。用重组技术分别从前期构建的5’半长cDNA或3’半长cDNA 中替换F1、F3 和F51,构建成两个新的半长cDNA,进一步连接成新的全长cDNA,经测序证实全长cDNA中3个致死性突变位点均得到改正。借助脂质体转染技术转染SK-6 细胞,检测了CSFV 的抗原表达和特异性核酸序列,结果表明该全长cDNA 具有感染性。成功地建立了CSFV C-株反向遗传操作系统,为从事CSFV 分子生物学研究提供了重要的技术平台。本研究进一步利用该感染性克隆作为骨架,利用猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5 基因作为标记基因,通过基因工程技术插入CSFV Npro基因的起始密码子ATG 后,借助脂质体转染SK-6 细胞,检测了包含PRRS 病毒GP5 基因的一段重组序列及CSF 病毒的抗原表达,结果表明GP5 基因在细胞连续传代5 到10 代后仍然稳定的插入在CSFV的序列中,培养细胞中存在猪瘟抗原,由于构建的重组病毒可通过检测GP5 区段的特异序列区别于猪瘟野毒,另外,标记基因为PRRSV 的主要抗原基因,因而该重组体可望作为CSFV C-株活病毒标记疫苗,用于CSF 和PRRS 的免疫预防。
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全文目录
中文摘要 6-7 英文摘要 7-12 文献综述 12-44 第一章 猪瘟及猪瘟病毒的研究进展 12-27 1 猪瘟的研究进展 12-18 1.1 猪瘟概述 12-13 1.2 猪瘟的流行和分布 13-14 1.3 猪瘟的临床症状和致病机理 14-16 1.4 猪瘟的诊断 16-17 1.5 猪瘟的防治 17-18 1.6 猪瘟的传统疫苗 18 2 猪瘟病毒的病原学特征及研究进展 18-21 2.1 猪瘟病毒的形态及理化特性 18-19 2.2 猪瘟病毒的基因组结构及研究进展 19-21 3 猪瘟病毒的增殖及细胞培养 21-27 3.1 CSFV 的入侵及增殖 21-22 3.2 猪瘟病毒对宿主细胞的致病机理 22-23 3.3 猪瘟病毒的细胞培养 23-27 第二章 瘟病毒蛋白结构和功能的研究进展 27-34 1 结构蛋白的结构和功能 27-29 1.1 核衣壳蛋白C 27 1.2 Erns 27-28 1.3 囊膜糖蛋白E1 28 1.4 囊膜糖蛋白E2 28-29 2 非结构蛋白的结构和功能 29-33 2.1 Npro 蛋白 29-30 2.2 p7 蛋白 30-31 2.3 NS2-3、NS2 和NS3 蛋白 31-32 2.4 NS4A 和NS4B 蛋白 32 2.5 NS5A 蛋白 32 2.6 NS5B 蛋白 32-33 3 小结和展望 33-34 第三章 猪瘟标记疫苗的研究进展 34-39 1 猪瘟疫苗研究的历史回顾 34 2 猪瘟标记疫苗研制的意义 34-35 3 猪瘟标记疫苗的研究 35-39 3.1 猪瘟亚单位标记疫苗的研究 35-37 3.1.1 亚单位疫苗的研究 35-36 3.1.2 猪瘟E2 亚单位疫苗的研究 36-37 3.2 猪瘟重组标记疫苗的研究 37-39 第四章 动物致病性正链RNA 病毒逆向遗传学研究进展 39-44 1 研究动物正链RNA 病毒感染性cDNA 的意义 39 2 逆向遗传学研究的理想系统及影响cDNA 感染性的因素 39-41 2.1 构建感染性cDNA 的理想系统 39 2.2 影响感染性的因素 39-41 2.2.1 非完整基因组与完整基因组的比例 39-40 2.2.2 扩增和克隆增殖过程中的突变 40 2.2.3 基因组5’末端碱基冗余或缺失 40 2.2.4 基因组3’末端碱基冗余 40-41 2.2.5 基因组中帽子结构 41 3 动物正链RNA 病毒基因组克隆应用概况 41-44 3.1 进一步揭示病毒的分子特征 41-42 3.2 研究新型疫苗 42 3.3 开发新的基因工程载体 42 3.4 研究重构病毒可以代替实验动物模型 42 4 小结 42-44 试验研究 44-65 第五章 猪瘟病毒C-株兔脾毒在SK-6 细胞中的增殖培养及其鉴定 44-49 1 材料与方法 44-46 1.1 材料 44 1.1.1 种毒 44 1.1.2 试剂 44 1.2 方法 44-46 1.2.1 病毒的提取 44-45 1.2.2 SK-6 细胞的复苏和培养 45 1.2.3 细胞接毒和样品采集 45 1.2.4 病毒的检测 45-46 1.2.4.1 毒抗原的直接荧光抗体检测 45 1.2.4.2 病毒抗原的夹心ELISA 检测 45 1.2.4.3 病毒RNA 的RT-PCR 检测 45-46 2 结果 46-47 2.1 直接荧光抗体染色结果 46 2.2 病毒抗原的夹心ELISA 检测结果 46-47 2.3 病毒RNA 的RT-PCR 检测结果 47 3 讨论 47-49 第六章 猪瘟病毒C-株(脾淋毒)全长CDNA 分子几个突变位点的重组改造 49-58 1 材料与方法 49 1.1 材料 49-50 1.1.1 待改造CSFV C-株(脾淋毒) 49-50 1.1.2 试剂与引物 50 1.2 方法 50-52 1.2.1 RT-PCR 及3 个待替换cDNA 片段的亚克隆 50 1.2.2 全长cDNA 的改造 50-51 1.2.2.1 5’半长cDNA 中F1 片段的替换改造 50-51 1.2.2.2 5’半长(NF1)中F3 片段的替换改造 51 1.2.2.3 3’半长cDNA 中F51 片段的替换改造 51 1.2.2.4 全长cDNA 的重新连接 51 1.2.3 感染性的初步鉴定 51-52 1.2.3.1 模板DNA 的线性化 51 1.2.3.2 体外转录及纯化处理 51 1.2.3.3 转录产物的电泳鉴定 51 1.2.3.4 转染SK-6 细胞 51 1.2.3.5 病毒抗原和核酸序列的鉴定 51-52 2 结果 52 2.1 cDNA 合成及PCR 52 2.2 PCR 产物的克隆及序列测定 52-53 2.3 全长cDNA 的改造及鉴定 53-55 2.3.1 5’半长cDNA 和3’半长cDNA 的改造 53-55 2.3.2 全长cDNA 的重新连接和鉴定 55 2.4 感染性的鉴定 55-56 2.4.1 病毒抗原的夹心ELISA 检测结果 55-56 2.4.2 病毒RNA 的RT-PCR 检测结果 56 3 讨论 56-58 第七章 猪瘟病毒C-株重组标记疫苗的构建 58-65 1 材料与方法 58 1.1 材料 58 1.1.1 重组质粒 58 1.1.2 试剂与引物 58 1.2 方法 58-60 1.2.1 GP5 基因的插入和pGEM-5zf(+)/NFL/GP5 克隆的构建 58-60 1.2.1.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5 基因的PCR 扩增 58-59 1.2.1.2 F11 和F12 的PCR 扩增 59 1.2.1.3 pMD-18T/F1/GP5 重组质粒的构建及其阳性克隆的鉴定 59 1.2.1.4 pGEM-5zf(+)/N5’/GP5 重组质粒的构建及其鉴定 59-60 1.2.1.5 pGEM-5zf(+)/NFL/GP5 的构建及其鉴定 60 1.2.2 重组病毒复制及病毒抗原的检测 60 1.2.2.1 重组病毒核酸序列的RT-PCR 检测 60 1.2.2.2 重组病毒猪瘟抗原的夹心ELISA 检测 60 2 结果 60 2.1 GP5 基因的插入和全长pGEM-5zf(+)/NFL/GP5 克隆的构建 60-62 2.1.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5 基因的PCR 扩增 60-61 2.1.2 F11 和F12 的PCR 扩增 61 2.1.3 pMD-18T/F1/GP5 重组质粒的构建及其阳性克隆的鉴定 61-62 2.1.4 pGEM-5zf(+)/N5’/GP5 重组质粒的构建及其鉴定 62 2.1.5 pGEM-5zf(+)/NFL/GP5 的构建及其鉴定 62 2.2 重组病毒复制及病毒抗原的检测 62-63 2.2.1 重组病毒核酸序列的RT-PCR 检测 62-63 2.2.2 重组病毒猪瘟抗原的夹心ELISA 检测 63 3 讨论 63-65 结论 65-66 参考文献 66-77 作者简介 77-78 致谢 78
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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学(兽医学) > 兽医基础科学 > 血清学
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