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黄瓜花叶病毒与番茄不孕病毒RNA重组机制的初步探讨

作　者: 高瑜泽
导　师: 刘红梅
学　校: 山东农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: RNA重组假重组体体外转录重组中间体黄瓜花叶病毒(CMV) 番茄不孕病毒(TAV) 克氏烟(N. Clevelandii)
分类号: S432.41
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

病毒起源和进化的历程预示着病毒未来的变异方向,病毒的进化往往产生致病性更强的新毒株,因此了解病毒变异进化的规律,有助于制定更有针对性的抗病毒策略,避免病毒病的大面积暴发流行。大多数植物病毒为RNA病毒,而RNA重组是RNA病毒进化的主要方式之一。RNA重组的现象在越来越多的RNA病毒中得到证实,但重组机制尚不完全清楚。本研究以黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus ,CMV）和番茄不孕病毒（Tomato aspermy virus ,TAV）---两种同属RNA基因组病毒为研究对象,通过体外转录获得CMV RNA1、CMV RNA2及TAV RNA3,组合成假重组病毒,分别接种克氏烟（N.Clevelandii）,通过检测重组发生情况及重组病毒的致病性,对植物病毒RNA的重组机制进行了初步探讨,具体结果如下:（1）以带有T7启动子的病毒基因组RNA的cDNA克隆载体CMV RNA1,CMV RNA2_T2B,CMV RNA2,CMV RNA2_W2B和TAV RNA3_{△163（A）}为模板,体外转录获得病毒RNA,将不同来源的RNA1,RNA2和RNA3进行人工组合,获得3种假重组体病毒c2(C1C2 T3_{△163（A）}),qt(C1C2_T2BT3_{△163（A）})和qw(C1C2_W2BT3_{△163（A）})。（2）将人工构建的假重组体c2,qt,qw分别接种克氏烟,结果表明,c2（带有Q-CMV2b）没有侵染活性,qt（带有V-TAV2b）和qw（带有WAⅡ-CMV2b）在克氏烟上都有侵染活性,qt的侵染症状比qw更为严重,而且qt和qw的侵染症状均重于Q-CMV,这表明不同来源2b蛋白会影响假重组病毒的症状表现。（3）提取3种假重组体侵染14dpi,28dpi和35dpi时的系统发病叶片总RNA,分别以CMV和TAV特异性探针进行Northern blot分析,结果显示,接种35dpi时qt在CMV RNA3的位置出现一条新的CMV特异性条带,但位置在CMV RNA3条带之上,RT-PCR及序列比对分析表明,人工假重组体qt的TAV RNA3与CMV RNA1之间发生了重组,表明TAV2b能促进RNA重组的发生。此过程涉及多种不稳定重组中间体,且重组位点呈现多样化。（4）序列分析结果显示,重组位点总是分布在TAV RNA3的2109nt-2386nt的277 nt的区间内,并且发生重组的2条RNA序列的重组位点附近有同源序列5′-AGGTC CGAAGACGTTAAACTAC-3′（box1）,但是重组位点并不在同源序列内,而是位于其下游非同源区,显然box1并没有起到促进同源重组的作用。其中,最长的重组体的序列是在TAV RNA3的末端,搭接CMV RNA1的保守区310nt。这种重组方式较为特别,可能是一种新的重组机制。所有的重组中间体的3′端都带有Q-CMV RNA的高度保守TLS序列,可能由于在病毒复制过程中,起复制作用的是CMV复制酶,而它对于CMV 310nt的起始识别更有效,而这个高度保守区能协助复制酶找到编码阅读框下游的搭接位点,因而能更好的合成RNA。（5）构建重组中间体病毒的克隆载体,体外转录,获得中间体假重组体病毒。分别侵染克氏烟,症状大概一致,均为斑驳,明脉,暗绿等,与CMV侵染症状类似。结合RT-PCR分析,筛选出稳定存在的重组病毒C1C2_T2BT3_pRE-8。其RNA3序列与最长的中间体序列一致。推测可能是TAV3_pRE-8的3′端的高度保守区,增加了病毒C1C2_T2BT3 pRE-8的侵染活性,相对于其他重组中间体更具有竞争优势,因此稳定存活。侵染克氏烟转接四代后,提纯病毒,侵染不同种烟草,进行症状分析。发现C1C2_T2BT3_pRE-8致使心叶烟（N. glutinosa）顶端坏死,推测2b蛋白与寄主的互作促使了坏死的发生。其他烟草表现为不同程度的花叶或斑驳。

全文目录

中文摘要  8-10
英文摘要  10-12
1 前言  12-24
  1.1 病毒RNA 重组的发现  12
  1.2 RNA 重组的类型  12-14
    1.2.1 同源重组  12-13
    1.2.2 非同源重组  13-14
    1.2.3 同源辅助性重组  14
  1.3 RNA 重组的机制  14-20
    1.3.1 同源重组的机制  14-15
    1.3.2 非同源重组的机制  15-16
    1.3.3 同源辅助性重组的机制  16
    1.3.4 研究 RNA 重组机制的方法  16-17
    1.3.5 三种重要病毒的 RNA 重组  17-18
    1.3.6 植物病毒进化过程中重组的方式  18-19
    1.3.7 重组的生物学意义  19-20
  1.4 黄瓜花叶病毒  20-22
  1.5 本研究的目的意义和主要内容  22-24
2 材料与方法  24-40
  2.1 材料  24-25
    2.1.1 毒源  24
    2.1.2 植物材料  24
    2.1.3 菌株、质粒  24
    2.1.4 引物  24-25
    2.1.5 其他试剂  25
    2.1.6 主要实验仪器  25
  2.2 实验方法  25-40
    2.2.1 病毒基因组全长克隆的获得  25-28
    2.2.2 转录本的获得  28-30
    2.2.3 3 种人工假重组体的获得  30
    2.2.4 假重组病毒侵染烟草  30-31
    2.2.5 Northern blot 检测  31-35
    2.2.6 RT-PCR 对重组RNA3 的检测  35-36
    2.2.7 重组中间体re1、re8 克隆载体的构建  36-38
    2.2.8 重组中间体re2、re13、re17 克隆载体的构建  38-39
    2.2.9 ELISA 法检测  39-40
3 结果与分析  40-53
  3.1 获得病毒基因组的cDNA 克隆  40-41
  3.2 病毒cDNA 克隆载体的酶切鉴定  41-42
  3.3 转录本的获得  42-44
    3.3.1 质粒模板的线性化  42
    3.3.2 质粒模板的纯化  42-43
    3.3.3 质粒模板的体外转录  43
    3.3.4 人工假重组体的获得  43-44
  3.4 假重组体病毒c2,qt ,qw 对N.clevelandii 的症状影响  44-45
  3.5 假重组体病毒c2,qt ,qw 侵染N.clevelandii 的Northern blot 检测结果  45-46
  3.6 重组RNA3 的RT-PCR 验证  46-47
  3.7 重组中间体的序列分析  47-49
    3.7.1 重组中间体的克隆载体的构建  47-48
    3.7.2 子代重组RNA3 的序列分析  48-49
  3.8 重组中间体全长克隆载体的构建  49-50
    3.8.1 re1,re8 克隆载体的构建及酶切鉴定  49
    3.8.2 re2、re13、re17 克隆载体的构建及鉴定  49-50
  3.9 重组中间体病毒的获得  50
  3.10 重组中间体病毒的症状分析  50-52
  3.11 ELISA 对病毒含量的检测  52-53
4 讨论  53-56
  4.1 qt 重组RNA3 涉及不稳定重组中间体  53
  4.2 2b 蛋白影响了重组RNA 的选择  53-54
  4.3 基元序列 Box1 对于重组的影响  54-55
  4.4 2b 蛋白引起心叶烟大芽坏死  55-56
5 结论  56-57
参考文献  57-65
致谢  65

黄瓜花叶病毒与番茄不孕病毒RNA重组机制的初步探讨

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