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MDR1启动子靶向的双自杀基因对耐药白血病细胞杀伤作用的实验研究

作　者: 王向玲
导　师: 纪春岩
学　校: 山东大学
专　业: 内科学
关键词: 多药耐药基因(MDR) 启动子自杀基因白血病体外杀伤效应基因治疗真核表达载体构建鉴定
分类号: R733.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

目的构建多药耐药基因(MDR1)启动子靶向的CD-TK双自杀基因高表达载体,观察其对耐药白血病细胞K562-A02细胞的选择性杀伤作用,探讨耐药白血病的靶向性基因治疗。方法采用PCR方法从K562-A02细胞基因组DNA扩增多药耐药MDR1启动子片段,并在其两端分别连接NdeⅠ和HindⅢ酶切位点,插入到具有相同酶切位点的pcDNA3-TK质粒中自杀基因TK的上游,通过电泳及DNA测序证实连接准确。获得含正确目的基因的表达载体pcDNA3-MDR1-Promoter-TK。用BamHⅠ单酶切pcDNA3-MDR1-Promoter-TK及pcDNA3-CD-TK,通过基因重组技术将CD基因连接到TK基因的上游,通过电泳及DNA测序证实连接准确。获得含正确目的基因的表达载体pcDNA3-MDR1-Promoter-CD-TK。通过脂质体介导的基因转染技术转入白血病细胞系K562-A02和K562细胞中,通过G418筛选获得稳定转染的细胞株。RT-PCR鉴定TK、CD基因的表达,以未转染细胞做对照,加用不同浓度的GCV、5-FC培养4天,MTT法测定细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果PCR扩增所得MDR1启动子片段的长度和序列通过电泳及DNA测序得到证实,采用PCR扩增及DNA测序证实pcDNA3-TK质粒中插入的MDR1启动子大小、位置及方向均正确。经限制性内切酶单酶切peDNA3-CD-TK获得1.3KbCD基因,通过基因重组技术成功将其插入同样酶切后的pcDNA3-MDR1-Promoter-TK质粒TK基因的上游,采用PCR扩增及DNA测序证实插入的CD基因的大小、位置及方向正确。成功构建含正确目的基因的表达载体pcDNA3-MDR1-Promoter-CD-TK。经脂质体转染入K562、K562-A02细胞内,RT-PCR鉴定CD、TK基因在多药耐药细胞株K562-A02中得到了表达,而敏感株不表达。加入GCV、5-FC后耐药白血病细胞较不耐药的白血病细胞有明显的杀伤效果,细胞存活率下降,联合用药组较较单药组细胞存活率更低,同时诱导细胞凋亡率也最高。

全文目录

中文摘要  4-8
  第一部分  6-7
  第二部分  7-8
英文摘要  8-14
  第一部分  10-12
  第二部分  12-14
主要英文缩略语  14-16
第一部分多药耐药基因(MDR1)启动子靶向的CD-TK双自杀基因真核表达载体的构建及鉴定  16-54
  前言  16-18
  材料与方法  18-30
  结果  30-32
  讨论  32-35
  结论  35-36
  附图  36-50
  参考文献  50-54
第二部分 MDR1启动子靶向的 CD-TK双自杀基因对多药耐药白血病细胞K562-A02体外杀伤作用的研究  54-88
  前言  54-56
  材料与方法  56-64
  结果  64-67
  讨论  67-73
  结论  73-74
  附图  74-82
  参考文献  82-88
致谢  88-89
攻读硕士学位期间发表的文章  89-90
学位论文评阅及答辩情况表  90

MDR1启动子靶向的双自杀基因对耐药白血病细胞杀伤作用的实验研究

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