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西尼罗病毒巢式RT-PCR和荧光定量RT-PCR两种检测方法的建立

作　者: 于萍
导　师: 李国平；王志亮；魏荣
学　校: 福建农林大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 西尼罗河病毒 巢式反转录PCR 荧光RT-PCR RT-PCR
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
下　载: 167次
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内容摘要


西尼罗河病毒是黄病毒科黄病毒属成员,与日本乙型脑炎病毒、墨累河谷脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒和昆津病毒同属日本脑炎病毒血清群。该病毒是虫媒病毒,主要经库蚊传播给人、马和鸟类等,可引发西尼罗河热和致死性的西尼罗河病毒性脑膜脑炎,其中西尼罗河热被国际兽疫局列为重大疾病。西尼罗河病毒分布广泛,已在世界上许多国家和地区引起流行,造成人、马和鸟类的大量感染及死亡,给发病国家造成重大危害,成为全球兽医界和公共卫生部门的一大难题。我国目前还没有发现西尼罗河病毒,但存在传入的风险,因此建立快速、准确的检测方法对于我国预防该病毒的入侵具有重大意义。 本文建立了检测西尼罗河病毒的巢式反转录PCR、荧光定量RT-PCR技术。 本研究采用西尼罗河病毒的1999年北美分离株,针对该病毒的保守蛋白E基因设计了巢式反转录PCR的引物,引物经Blast和常规PCR鉴定具有很好的特异性。试验采用的RNA模板来自质粒DNA的体外转录产物。反应的第一步反转录PCR和第二步巢式PCR分别扩增出长度为445bp和248bp的两条片段。该法的特异性和敏感性均很好,可检测到拷贝数为6×10~0拷贝的病毒RNA。 荧光PCR反应产生实验室交叉污染的机率比巢式反转录PCR要低得多。本研究中,试验者建立了基于TaqMan探针的反转录荧光PCR技术,这种技术的最低敏感度达到3×10~1 RNA拷贝。本试验同样采用西尼罗河病毒的1999年纽约分离株进行研究,针对该病毒的E基因区设计了一对寡核苷酸引物和一条由FAM和TAMRA标记的特异性探针,反应的模板RNA来自质粒DNA的体外转录产物。试验过程中还对荧光RT-PCR方法和常规RT-PCR方法的敏感性进行了比较,结果表明荧光RT-PCR技术的特异性和敏感性均高于常规RT-PCR法。

全文目录


目录  5-8
符号说明  8-9
摘要  9-10
ABSTRACT  10-12
引言  12
西尼罗河病毒研究进展  12-36
  1 西尼罗河病毒简介  12-15
    1.1 西尼罗河病毒病原学  12-13
    1.2 临床表现  13-15
  2 流行病学  15-17
    2.1 传染源  15
    2.2 传播媒介  15
    2.3 传播方式  15-16
    2.4 易感动物  16-17
    2.5 流行分布特点  17
  3 世界流行趋势  17-19
    3.1 流行简史  17-18
    3.2 重大历史事件  18-19
  4 诊断技术研究进展  19-21
    4.1 ELISA技术  19-20
    4.2 反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术  20
    4.3 反转录巢式聚合酶链式反应(RT-nPCR)技术  20
    4.4 实时荧光定量反转录PCR(Real time RT-PCR)技术  20-21
    4.5 基于核酸序列的扩增(Nucleic Acid Sequenee-based Amplifieation Assay，NASBA，也称自主序列复制)技术  21
  5 西尼罗河病毒传入我国的风险分析  21-22
  6 我国防范西尼罗病毒入侵的措施  22-23
  7 小结  23-24
  参考文献  24-36
第一章 西尼罗河病毒反转录巢式PCR(RT-NPCR)检测方法的建立  36-52
  1 材料和方法  36-45
    1.1 重组质粒和日本乙型脑炎病毒冻干苗  36-37
    1.2 引物的设计与合成  37
    1.3 主要试剂  37
    1.4 主要仪器设备  37
    1.5 原始质粒的转化和扩增及日本乙型脑炎病毒病毒RNA的提取  37-38
    1.6 常规PCR法扩增目的片段  38
    1.7 琼脂糖凝胶电泳  38
    1.8 用于体外转录的DNA模板的构建  38-41
    1.9 体外转录  41-43
    1.10 RT-nPCR检测技术的建立  43-45
  2 结果  45-49
    2.1 常规PCR法扩增目的片段切胶纯化结果  45
    2.2 菌液PCR筛选阳性菌落结果  45-46
    2.3 体外转录模板的线性化结果  46
    2.4 体外转录结果  46
    2.5 RT-nPCR扩增目的片段及特异性反应结果  46-48
    2.6 RT-nPCR的敏感性试验结果  48-49
  3 讨论  49-51
  参考文献  51-52
第二章 西尼罗河病毒基于TAQMAN探针REAL TIME RT-pCR检测方法的建立  52-70
  1 材料和方法  52-60
    1.1 重组质粒及日本乙型脑炎病毒冻干苗  52-53
    1.2 引物和探针的设计与合成  53
    1.3 主要试剂  53
    1.4 主要仪器设备  53-54
    1.5 Real time RT-PCR检测方法的建立  54-60
  2 结果  60-66
    2.1 常规PCR法扩增目的片段结果及切胶纯化PCR产物结果  60-61
    2.2 菌液PCR筛选阳性菌落结果  61-62
    2.3 阳性菌液测序结果  62
    2.4 体外转录模板的线性化结果  62
    2.5 体外转录结果及纯化后结果  62-63
    2.6 常规RT-PCR敏感性分析结果  63
    2.7 Real time RT-PCR扩增目的片段及特异性反应结果  63-65
    2.8 Real-time RT-PCR敏感度分析及其标准曲线的建立  65-66
  3 讨论  66-68
  参考文献  68-70
结论  70-73

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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