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香蕉成熟相关基因的克隆及表达的定量分析

作　者: 张德有
导　师: 金志强
学　校: 华南热带农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 香蕉 凝集素（Lectin）基因 果胶裂解酶（Pectate Lyase）基因 定量PCR 竞争性PCR
分类号: S668.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2002年
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内容摘要


本研究通过RT-PCR和PCR扩增的方法，从巴西香蕉(Musa Acuminata AAA.SPP.)果实中扩增得到四条片段——香蕉凝集素(Lectin)基因cDNA片段和DNA片段、香蕉果胶裂解酶(Pectate Lyase)基因cDNA片段和DNA片段。分别将它们与pGEM-T Easy Vector连接，转化E.coli DH5α，得到重组子，经酶切鉴定和PCR鉴定后，进行了序列的测定。通过序列分析得知，香蕉凝集素(Lectin)基因cDNA片段长508 bp；香蕉凝集素(Lectin)基因DNA片段长575bp，有一个长为67bp的内含子；香蕉果胶裂解酶(Pectate Lyase)基因cDNA片段长1，316bp；香蕉果胶裂解酶(Pectate Lyase)基因DNA片段长1，858bp，有三个内含子区，分别长90 bp，83 bp和370bp；在总共的四个内含子序列中，分别都符合GT-AG规则。此四条片段的核苷酸序列分别与GenBank中发表的Lectin基因(AF001527)及Pectate Lyase基因(X92943)具有95％以上的同源性。同时，香蕉凝集素(Lectin)基因的cDNA片段和DNA片段所推测出的氨基酸序列与GenBank中发表的Lectin基因(AF001527)的氨基酸序列也具有93％以上的同源性。 本研究还用RT-PCR的方法对香蕉凝集素(Lectin)基因和香蕉果胶裂解酶(Pectate Lyase)基因在香蕉不同组织和果实采后不同成熟阶段的表达情况进行了研究。分别提取香蕉根、叶、及不同成熟阶段果皮和果肉共12个组织的Total RNA，通过RT-PCR，结果发现香蕉果胶裂解酶(Pectate Lyase)基因在四个组织阶段中特异表达，分别是：成熟度4、5的果皮和成熟度3、4的果肉组织；香蕉凝集素(Lectin)基因在七个组织阶段特异表达。分别是：成熟度2、3、4的果皮和成熟度2、3、4、5的果肉组织。证明这两个基因都具有组织特异性，都在果实特定的成熟阶段表达，并且在果皮和果肉中表达的成熟阶段也不一样。 在这两个基因表达的定性研究之后，还对这两个基因的表达进行了定量研究。 首先通过定量PCR方法研究香蕉果胶裂解酶(Pectate Lyase)基因的表达情况。发现香蕉果胶裂解酶(Pectate Lyase)基因在四个组织中的表达强度依次为：成熟度4果肉＞成熟度3果肉＞成熟度5果皮＞成熟度4果皮。 其后通过竞争性PCR技术对香蕉凝集素(Lectin)基因的表达情况进行相对定量研究。结果显示成熟度2的果皮组织中，每微克Total　RNA含有0.012，665 张惋有：晋唬地硫书共总困的记险及取这的灭骨方折ng转录本；成熟度3的果皮组织中，每微克Total RNA含有0刀19，149 un转录本；成熟度4的果皮组织中，每微克Total RNA含有 0．001，564 ng转录本；成熟度2的果肉组织中，每微克Total RNA含有＊739，199 ng转录本；成熟度3的果肉组织中，每微克Total RNA含有又963，732 ng转录本；成熟度 4的果肉组织中，每微克 TOtal RNA含有 4．879，877 ng转录本；成熟度 5的果肉组织中，每微克 TOtal RNA含有 3．584，009 ng转录本。 参照相关研究的结果，关于应用PCR技术，特别是关于应用竞争性PCR技术来检测基因的表达情况，进行了讨论。 最后，将香蕉凝集素儿ect士）基因的DNA片段登录到GenBank，登录号 （GenBank Accession Number）为：AY103481。

全文目录


目录  4-7
中文摘要  7-9
英文摘要  9-11
第一部分 前言及文献综述  11-25
  1．1 国内外香蕉生产、消费概况  11
  1．2 香蕉成熟的分子生物学研究  11-18
    1．2．1 成熟机理  11-13
    1．2．2 香蕉成熟中乙烯的研究  13-15
    1．2．3 香蕉成熟中果实软化的研究  15-16
    1．2．4 香蕉成熟中糖类、色素和香味物质的研究  16
    1．2．5 香蕉成熟中其他的研究  16-17
    1．2．6 关于香蕉分子生物学研究的讨论与展望  17-18
  1．3 定量PCR技术研究进展  18-20
    1．3．1 概述  18
    1．3．2 竞争性PCR  18-19
    1．3．3 关于定量PCR技术的展望  19-20
  1．4 Pectate Lyase基因的分子生物学  20-21
  1．5 Lectin基因的分子生物学  21-22
  1．6 本研究的目的和意义  22-24
  1．7 本研究的技术路线  24-25
第二部分 香蕉凝集素（Lectin）基因、香蕉果胶裂解酶（Pectate Lyase）基因cDNA片段和DNA片段的克隆与测序  25-48
  2．1 材料与试剂  25
  2．2 方法  25-37
    2．2．1 香蕉果肉总RNA的提取  25-27
    2．2．2 成熟度3香蕉果肉cDNA第一链的合成  27
    2．2．3 香蕉基因组DNA的提取（CTAB法）  27-28
    2．2．4 PCR引物的设计与合成  28-29
    2．2．5 目的条带的扩增  29-31
    2．2．6 目的片段的回收  31
    2．2．7 目的片段的克隆  31-33
    2．2．8 重组体的筛选与鉴定  33-35
    2．2．9 重组子阳性克隆菌的保存  35
    2．2．10 目的片段的测序  35
    2．2．11 序列的分析  35
    2．2．12 GenBank基因登录  35-37
  2．3 结果与分析  37-48
    2．3．1 香蕉果肉总RNA的提取  37
    2．3．2 香蕉基因组DNA的提取  37
    2．3．3 四条目的片段的扩增  37-38
    2．3．4 重组质粒的酶切鉴定  38-39
    2．3．5 重组质粒PCR鉴定  39-40
    2．3．6 序列分析  40-47
    2．3．7 GenBank基因登录  47
    2．3．8 四条片段克隆与测序小节  47-48
第三部分 香蕉果胶裂解酶（Pectate Lyase）基因的表达研究  48-54
  3．1 实验材料  48-49
    3．1．1 果实的采集与处理  48
    3．1．2 根、叶组织的采集与处理  48
    3．1．3 香蕉各成熟度的划分  48-49
  3．2 实验方法  49-50
    3．2．1 香蕉不同组织阶段Total RNA的提取  49-50
    3．2．2 香蕉不同组织阶段第一链cDNA的合成  50
    3．2．3 香蕉果胶裂解酶（Pectate Lyase）基因表达的定性研究  50
    3．2．4 香蕉果胶裂解酶（Pectate Lyase）基因表达的定量研究  50
  3．3 实验结果  50-54
    3．3．1 香蕉不同组织阶段Total RNA的提取  50-52
    3．3．2 香蕉果胶裂解酶（Pectate Lyase）基因表达的定性研究  52
    3．3．3 香蕉果胶裂解酶（Pectate Lyase）基因表达的定量研究  52-54
第四部分 香蕉凝集素（Lectin）基因在不同组织、发育阶段的表达研究  54-55
  4．1 实验材料  54
  4．2 实验方法  54
    4．2．1 香蕉不同组织阶段Total RNA的提取及第一链cDNA的合成  54
    4．2．2 香蕉凝集素（Lectin）基因表达的定性研究  54
  4．3 实验结果  54-55
    4．3．1 香蕉凝集素（Lectin）基因表达的定性研究  54-55
第五部分 应用竞争性PCR技术研究香蕉凝集素（Lectin）基因的表达  55-74
  5．1 实验方法  55-57
    5．1．1 竞争性对照的选取  55
    5．1．2 对照质粒PCR的特异性和敏感性的测定  55-56
    5．1．3 竞争性PCR  56
    5．1．4 竞争性PCR的结果统计  56-57
  5．2 实验结果  57-74
    5．2．1 对照质粒PCR的特异性和敏感性  57-58
    5．2．2 竞争性PCR及结果的统计分析  58-74
第六部分 结论与讨论  74-78
参考文献  78-85
附录A 香蕉凝集素（Lectin）基因cDNA片段的测序结果  85-86
附录B 香蕉凝集素（Lectin）基因DNA片段的测序结果  86-88
附录C 香蕉果胶裂解酶（Pectate Lyase）基因eDNA片段的测序结果  88-90
附录D 香蕉果胶裂解酶（Pectate Lyase）基因DNA片段的测序结果  90-93
附录E SAS 6．12程序1的运行完整结果  93-95
附录F SAS 6．12程序2的运行完整结果  95-97
附录G SAS 6．12程序3的运行完整结果  97-99
附录H SAS 6．12程序4的运行完整结果  99-101
附录I SAS 6．12程序5的运行完整结果  101-103
附录J SAS 6．12程序6的运行完整结果  103-105
附录K SAS-6．12程序7的运行完整结果  105-107
致谢  107

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 果树园艺 > 多年生草本果类 > 香蕉
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