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HFRS疫苗志愿接种者PBL中CD4~+T、CD8~+T细胞TCRβ链CDR3谱系的监测及CDR3分子特征初步分析

作　者: 马庆庆
导　师: 罗军敏；姚新生
学　校: 遵义医学院
专　业: 免疫学
关键词: 肾综合征出血热(HFRS) HFRS疫苗 T细胞受体互补决定区3 荧光定量PCR 熔解曲线
分类号: R392.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的(1)探讨肾综合征出血热(Hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)疫苗志愿接种者,在疫苗接种前和接种后外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocytes,PBL)中,CD4+T、CD8+T细胞TCRβ链各家族互补决定区(complementarity determining region,CDR)3谱系漂移和CDR3的分子特征；(2)初步分析HFRS疫苗志愿接种者接种后CD4+T、CD8+TTCRβ链各家族CDR3谱系漂移和人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)的相关性；(3)选取部分疫苗志愿接种者接种疫苗后,呈显著变化的TRBV(TCRβchain variable gene,TRBV)优势利用家族CDR3进行克隆测序,生物信息学分析CDR3区的基因、氨基酸组成和特征。方法(1)在遵医2008级研究生中筛选出10例汉坦病毒(hantavirus. HV)抗体阴性HFRS疫苗志愿接种者,按HFRS疫苗接种程序和要求,完成HFRS疫苗的三次接种,并于接种前0天、接种1个月后、接种6个月后采集外周血样本(15ml/次)；免疫磁珠法(Magnetic Activated Cell Sorting,MACS)分选PBL中的CD4+T细胞、CD8+T细胞,流式细胞仪检测分选纯度；(2)设计并合成人T细胞26个TRBV家族上游引物、1个TRBC (TCRβchain constant gene,TRBC)下游引物；以10例汉坦病毒(hantavirus,HV)抗体阴性的HFRS疫苗志愿接种者接种前、后的外周血PBL中的CD4+T细胞、CD8+T细胞为研究样本,；提取各样本CD4+T细胞、CD8+T细胞中的总RNA,逆转录成cDNA,利用各TRBV家族特异性引物,荧光定量PCR(FQ-PCR)扩增26个TRBV家族包含完整CDR3区段的cDNA;FQ-PCR熔解曲线法分析HFRS疫苗志愿接种者接种前、后CD4+T、CD8+T细胞TCRβ链的26个TRBV家族CDR3谱系漂移的特征；(3)提取10例HFRS疫苗志愿接种者基因组DNA,采用PCR-SBT (Sequencing based typing,SBT)法测序HLA-A、HLA-DR、HLA-DQ等位基因序列,初步分析疫苗接种前后TRBV家族CDR3谱系漂移和HLA的关系；(4)选取部分疫苗志愿接种者接种疫苗后,呈显著变化的TRBV家族CDR3,进行普通PCR; PCR产物回收后进行克隆测序,生物信息学分析其CDR3区基因序列、氨基酸序列的组成和特征。结果(1)10例HFRS疫苗志愿接种者,在接种后CD4+T、CD8+T细胞的26个TRBV家族CDR3的熔解曲线谱系图中,多数家族和接种前比较无变化,但每个志愿者均出现一个或几个TRBV家族CDR3的优势利用；(2)10例HFRS疫苗志愿接种者接种前和接种后CD4+T和CD8+T细胞出现的优势利用TRBV家族并不相同,不同志愿接种者之间存在共同优势利用的家族；(3)在CD8+T细胞研究中,对两例HLA-A分子相同的志愿接种者(NO.6、NO.10)的优势利用家族(TRBV6、11; TRBV5.1、13.1)测序发现：两例HLA-A分子相同的个体的优势利用家族并不是同一种CDR3序列的T细胞克隆增殖,但是CDR3氨基酸序列分析,二者之间存在一些共同的基序(如：GYT、EQY、NEQF、GG、TEAF、GELF等)。结论(1) HFRS疫苗志愿接种者接种前和接种后TCR CDR3谱系的变化,提示HFRS疫苗接种诱导了机体相应的T细胞应答；(2)CD4+T和CD8+T细胞出现的优势利用TRBV家族CDR3的多样性,提示：HV抗原的多样性和个体之间不同的HLA分子造成了机体T细胞应答的多样化,同时T细胞对HFRS疫苗的应答和HLA表现一定的相关性；(3)两例HLA-A分子相同的志愿接种者(NO.6、NO.10)优势利用家族CDR3含有的共同基序,提示这些优势利用的T细胞识别HV抗原肽的相同抗原表位。

全文目录

英汉缩略语对照  4-6
中文摘要  6-8
Abstract  8-10
前言  10-19
实验材料  19-21
实验方法  21-28
结果  28-52
讨论  52-56
结论  56
参考文献  56-59
综述  59-68
  参考文献  66-68
致谢  68-69
附录一其余HFRS疫苗志愿接种者CD8~+T TCR β链26个TRBV家族CDR3 溶解曲线图  69-87
附录二其余HFRS疫苗志愿接种者CD4~+T TCR β链26个TRBV家族CDR3 溶解曲线图  87-105
附录三 10例HFRS疫苗志愿接种者CD4~+T、CD8~+T细胞流式细胞仪分析结果图  105-108
附录四示例-TCR β链CDR3区的测序结果及分析图  108-109
作者简介  109
在学期间参加的研究项目  109

HFRS疫苗志愿接种者PBL中CD4~+T、CD8~+T细胞TCRβ链CDR3谱系的监测及CDR3分子特征初步分析

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