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酶法生产S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的研究

作　者: 席玥
导　师: 张今
学　校: 吉林大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: S-腺苷甲硫氨酸 SAM合成酶酶促合成
分类号: TQ464
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,SAM)是甲硫氨酸(methionine, Met)的活性形式。SAM于1953年为Cantoni所发现。广泛存在于动物、植物和微生物体内,也是人体内一种重要的生理活性物质,参与了40多种生化反应。在生物体内,它的生物合成是由腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosylmethionine synthetase)[EC2. 5. 1. 6]催化甲硫氨酸(Met)和ATP反应完成,即来自于ATP的腺苷部分攻击Met的硫原子,生成高能量、活泼的有机锍化合物。人体内腺苷甲硫氨酸的合成和降解主要在肝脏完成。在生物学上,SAM是1碳、3碳和5碳基团的供体,主要具有以下几方面生理作用:(1)转甲基作用,腺苷甲硫氨酸含有活性甲基,是体内最重要的甲基供体。它的甲基可以转移到硫、氮、碳、氧原子上,参与体内物质的合成和代谢。许多含氮物质的生物合成都要从SAM获取甲基,如肌酸、胆碱、肾上腺素、松果素、肉碱等;SAM还参与核酸与蛋白质的甲基化修饰。RNA链上核糖的羟基和碱基的氨基在甲基化时都有SAM的参与、DNA的甲基化也越来越受到关注。(2) 转氨丙基作用,腺苷甲硫氨酸另一个重要功能是转氨丙基作用。其经脱羧后生成5’-腺苷甲基硫丙胺,将此物质中的氨丙基转移给腐胺或亚精胺,生成相应的亚精胺和精胺,它们是真核生物中重要的多胺,5’-甲基硫腺苷是副产物。在正常条件下,此代谢途径在体内代谢中所占份额不超过5%,而在肝移植和早期肝癌患者中,发现此代谢途径会被诱导强化。(3) 转硫作用,是半胱氨酸和谷胱甘肽(GSH)等含硫化合物的活性前体。通过转硫作用,其生成半胱氨酸,再经体内代谢,转变成GSH。GSH是体内硫储存库和细胞主要的抗氧化物。在慢性肝病患者中,GSH水平会下降,其部分原因是腺苷甲硫氨酸合成减少。对于腺苷甲硫氨酸的制备,文献报道可以从微生物发酵提取、化学合成<WP=42>或体外酶促合成得到。化学法合成因产率低,反应底物L-高半胱氨酸价格昂贵,反应产物为消旋体等缺点,而未能生产应用。通过微生物发酵生产SAM,也存在产率低,分离较复杂等缺点。酶促转化法以其终产物积累量高、分离纯化容易、反应周期以及无污染等优势成为SAM制备研究的热点之一。因此,通过酵母发酵表达SAM合成酶、酶催化转化、提取精制SAM,是目前生产SAM的最有效的途径。随着基因工程技术的发展和细胞代谢途径研究的进展,使得利用代谢工程有目的地改造细菌细胞成为可能。腺苷甲硫氨酸在细菌细胞内的代谢是甲硫氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、GSH等含硫化合物代谢的一部分。SAM合成酶广泛存在于动、植物和微生物体内。本文就不同来源SAM合成酶作一简要介绍。(1)大肠杆菌的SAM合成酶,Markham等报道了E. coli SAM合成酶基因(met K)的核苷酸序列,它位于大肠杆菌染色体图的65分处,由1152bp组成,编码Mr为41941的亚基。(2)酵母的SAM合成酶,Chiang等证明通过DEAE-纤维素分离发现酵母的SAM合成酶有2种类型,并分别以二聚体和四聚体的形式存在。Cherest等证明这两种类型的酶分别由2个不连锁的基因sam1和sam2所编码。Thomas等报道了Saccharomyces cerevisiae SAM合成酶基因sam1的核苷酸序列。Sam1的编码序列长1149bp,编码含382氨基酸残基的亚基,Mr为41800。Sam1和metK的同源性高达52%。Thomas等进一步报道了Saccharomyces cerevisiae SAM合成酶基因sam2的核苷酸序列。sam2的编码序列长1152bp,编码含384氨基酸残基的亚基,Mr为42300。sam1和sam2的同源性为83%,所编码的多肽氨基酸序列的同源性高达92%,说明Sam1和sam2为复制基因。(3)大鼠SAM合成酶,大鼠肝脏、肾脏、脑组织中都含有SAM合成酶。Cabrero等发现大鼠肝脏内有高分子量和低分子量2种SAM合成酶。高分子量SAM合成酶Mr为210000,是四聚体;低分子量Mr为110000,是二聚体。Saburo等从λgt1 1文库中分离得到编码大鼠肝脏SAM合成酶的cDAN克隆,编码含397氨基酸残基的亚基蛋白,Mr为<WP=43>43647。该cDNA克隆与met K有52%同源性。(4)其他,一些微生物SAM合成酶及其编码基因被陆续报道,如Bacillus subtilis的SAM合成酶由metE编码。另外,大豆、小麦等植物的SAM合成酶及其编码基因也被发现。Markham等用重组大肠杆菌SAM合成酶进行的转化实验发现了产物抑制问题。Markham等认为SAM是大肠杆菌SAM合成酶抑制剂,可以和SAM合成酶形成不活泼的酶复合物,它对ATP竞争性抑制(Ki=0.01mmol/L),又与L-甲硫氨酸呈反竞争性抑制(Ki=0.01mmol/L)。Pajares等构建了表达大鼠肝脏的SAM合成酶的重组大肠杆菌,并申请了专利。Matos等对不同种类SAM合成酶的活力作了比较,结果表明大鼠肝脏的SAM合成酶的比活力不高,但L-甲硫氨酸Km最低。酵母两种SAM合成酶的同功酶,即SAM合成酶-1和SAM合成酶-2,虽然两者的氨基酸同源性高达92%,但SAM合成酶-1存在产物抑制作用,而SAM合成酶-2却没有。而大肠杆菌合成酶虽然从反应速度和比活力上略好与酵母SAM合成酶,但SAM是大肠杆菌SAM合成酶抑制剂,可以和SAM合成酶形成不活泼的酶复合物,它对ATP竞争性抑制(Ki=0.01m mol/L),又与L-甲硫氨酸呈反竞争性抑制(Ki=0.01m mol/L),也存在着产物抑制问题。大鼠肝脏SAM合成酶的L-甲硫氨酸Km最低,其比活力不高。因此,经过综合分析我们选择将克隆得到的S.cerevisiae来源的SAM合成酶-2?

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提要  5-6
第一章概述  6-15
  1.1 前言  6-10
  1.2 S 腺苷甲硫氨酸的药理及临床研究  10-13
    1.2.1 药理研究  10-12
    1.2.2 临床应用研究  12-13
  1.3 本研究的意义  13-15
第二章 S 腺苷甲硫氨酸合成酶的表达及表达条件的优化  15-22
  2.1 实验部分  16-17
    2.1.1 实验材料与仪器  16-17
    2.1.2 实验方法  17
  2.2 实验结果及讨论  17-22
    2.2.1 重组菌的SAMS2表达及检测  18
    2.2.2 培养条件的优化  18-22
第三章酶促法合成S 腺苷甲硫氨酸  22-32
  3.1 实验部分  22-25
    3.1.1 仪器和试剂  22-23
    3.1.2 反应方法  23-24
    3.1.3 纯化方法  24-25
  3.2 结果及讨论  25-32
    3.2.1 酶源提取  25
    3.2.2 反应体系考察  25-29
    3.2.3 纯化条件考察  29-32
第四章 S 腺苷甲硫氨酸的稳定性及稳定性盐研究  32-36
  4.1 引言  32-34
  4.2 实验方法和实验结果  34-36
    4.2.1 实验方法  34
    4.2.2 实验结果  34-36
参考文献  36-40
致谢  40-41
摘要  41-44
ABSTRACT  44-46

酶法生产S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的研究

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