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高温胁迫对海带配子体的生理影响及SAMS基因的克隆与分析

作　者: 宣慧
导　师: 侯和胜
学　校: 辽宁师范大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 海带配子体高温胁迫生理指标 S-腺苷甲硫氨酸合成酶克隆与分析
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

随着海洋污染和温室效应等环境条件的恶化,海带养殖面临着逐渐升高的温度条件,海带的生长发育受到一定的威胁。海带是冷水性藻类并以配子体形式渡过夏季高水温期,因此在实际育种生产中培育和筛选出耐高温的品系有利于海带的养殖。本研究用不同高温(20、25、28、30℃)胁迫处理海带配子体,以15℃为对照,观察记录生长状态并测定叶绿素a、脯氨酸、可溶性糖、丙二醛的含量以及过氧化物酶活性随时间(1、3、5、7d)的变化趋势,实验结果表明:在20℃条件下,海带配子体的生长和各项生理指标无明显变化;在25℃条件下,细胞轻微萎缩,除叶绿素a含量逐渐下降外,其余各项生理指标均上升;在28、30℃条件下,细胞内容物萎缩分离、颜色变浅、细胞膜破裂、内容物溢出,培养1d后均见数量明显的死亡细胞,5～7d藻体细胞几乎全部死亡,其中丙二醛含量逐渐上升,叶绿素a含量、过氧化物酶活性下降,脯氨酸、可溶性糖含量均先上升后下降。S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)催化甲硫氨酸与ATP生物合成的产物S-腺苷甲硫氨酸是生物体内重要的中间代谢物质。SAMS受氧化、盐、低温胁迫以及乙烯利的显著诱导,不同SAMS在表达模式上存在较大差异。SAMS对植物抗逆、衰老、代谢和调控起重大作用。本研究通过RT-PCR技术从海带配子体中克隆到一个SAMS基因片段(LjSAMS基因片段):长度为612bp,编码204个氨基酸;蛋白质分子量为22136.26Da,理论等电点为5.08;疏水性最强的是第62位亮氨酸,亲水性最强的是第167位甘氨酸和第168位异亮氨酸;二级结构中无规卷曲、α-螺旋、β-转角、延伸链分别占40.69%、27.45%、11.76%、20.10%;出核肽位于第111位亮氨酸处;无信号肽、跨膜域和内含子;含有二个保守域,N端是1～70位氨基酸残基,中间是83～204位氨基酸残基;具有1个SAMS基因家族序列的信号肽序列GAGDQGimfGY(86~96位);第1～203位氨基酸残基与人SAMS蛋白晶体结构的序列一致性达到62.069%,以2p02A为模板构建出LjSAMS基因片段编码蛋白的三维结构模型;与其它10个物种的SAMS基因编码的氨基酸序列的一致性为74.67%,其中进化距离最近的是藻类植物长囊水云和条斑紫菜。该研究结果为进一步揭示海带抗高温的分子机制及培育和筛选抗高温的海带品系提供参考,为更好地研究SAMS基因的功能奠定基础,对探索SAMS基因在海带中的表达规律及代谢途径具有一定的意义。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-10
1 绪论  10-21
  1.1 海带的生物学概述与养殖育种  10-12
    1.1.1 海带的生物学概述  10-11
    1.1.2 海带的养殖和品种培育  11-12
  1.2 海带相关的研究进展  12-14
    1.2.1 海带生理学的研究  12-13
    1.2.2 海带生产技术的研究  13
    1.2.3 海带活性物质提取和应用的研究  13
    1.2.4 海带生态学的研究  13-14
    1.2.5 海带基因工程的研究  14
  1.3 高温胁迫对植物的影响  14-16
    1.3.1 高温胁迫对细胞膜系统的影响  14
    1.3.2 高温胁迫对植物生理活动的影响  14-15
    1.3.3 高温胁迫对植物生长发育的影响  15
    1.3.4 高温相关的生理生化效应  15-16
  1.4 S-腺苷甲硫氨酸合成酶研究进展  16-19
    1.4.1 S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因  17-18
    1.4.2 S-腺苷甲硫氨酸合成酶的结构特征  18
    1.4.3 S-腺苷甲硫氨酸的生物学意义  18-19
    1.4.4 S-腺苷甲硫氨酸在植物中参与胁迫相关的途径  19
  1.5 研究目的与意义  19-21
2 高温胁迫对海带配子体的生理影响  21-33
  2.1 实验材料  21
    2.1.1 材料培养与处理  21
    2.1.2 实验仪器  21
  2.2 实验方法  21-26
    2.2.1 生长状态的记录  21-22
    2.2.2 叶绿素a 含量的测定  22
    2.2.3 脯氨酸含量的测定  22-24
    2.2.4 可溶性糖含量的测定  24-25
    2.2.5 丙二醛含量的测定  25
    2.2.6 过氧化物酶活性的测定  25-26
    2.2.7 数据处理  26
  2.3 结果与分析  26-31
    2.3.1 高温胁迫对海带配子体生长状态的影响  26-28
    2.3.2 高温胁迫对海带配子体叶绿素a 含量的影响  28
    2.3.3 高温胁迫对海带配子体脯氨酸含量的影响  28-29
    2.3.4 高温胁迫对海带配子体可溶性糖含量的影响  29-30
    2.3.5 高温胁迫对海带配子体丙二醛含量的影响  30
    2.3.6 高温胁迫对海带配子体过氧化物酶活性的影响  30-31
  2.4 讨论  31-33
3 海带配子体S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆与序列分析  33-49
  3.1 实验材料  33
  3.2 实验仪器  33
  3.3 实验方法  33-39
    3.3.1 海带配子体总RNA 的提取  33-34
    3.3.2 cDNA 合成  34-35
    3.3.3 SAMS 基因的PCR 扩增  35-36
    3.3.4 PCR 产物的纯化回收  36
    3.3.5 回收片段的连接  36
    3.3.6 大肠杆菌感受态细胞的制备  36-37
    3.3.7 连接产物的转化和筛选  37-38
    3.3.8 重组质粒的鉴定  38-39
    3.3.9 海带配子体SAMS 基因的生物信息学分析  39
  3.4 结果与分析  39-47
    3.4.1 海带配子体总RNA 提取  39-40
    3.4.2 SAMS 基因RT-PCR 扩增  40-41
    3.4.3 菌液PCR 扩增检测  41
    3.4.4 SAMS 基因生物信息学分析  41-47
  3.5 讨论  47-49
结论  49-50
参考文献  50-54
攻读硕士学位期间发表学术论文情况  54-55
致谢  55

高温胁迫对海带配子体的生理影响及SAMS基因的克隆与分析

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