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腺病毒介导的鸟氨酸脱羧酶和S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶双反义RNA抑制肺癌A-549细胞的实验研究

作　者: 孙启峰
导　师: 田辉
学　校: 山东大学
专　业: 胸外科
关键词: 鸟氨酸脱羧酶 S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶多胺肺肿瘤基因治疗
分类号: R734.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

【研究目的】多胺包括精胺、精眯和腐胺,是调节细胞生长的重要物质,它可以通过改变DNA结构和调节信号传导途径等方式调节基因的表达,从而在细胞生长和分化过程中发挥着重要的作用。在多胺的生物合成过程中有两个限速酶:鸟氨酸脱羧酶（ornithine decarboxylase,ODC）是多胺合成的第一个限速酶,可催化L-鸟氨酸脱羧生成腐胺;S—腺苷甲硫氨酸脱羧酶（s-adenosylmethionine decarboxylase,SAMDC）是多胺合成的第二个限速酶,催化S-腺苷蛋氨酸成S—腺苷甲硫基丙胺。国外及国内研究证明在肺肿瘤细胞中多胺的含量明显增高,鸟氨酸脱羧酶及S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶的含量也明显增高,并与肺肿瘤的复发有一定的关系。多数学者认为多胺的过度生成与肿瘤的发生有关。如果能有效减弱多胺在肿瘤细胞中的过度表达,则可抑制肿瘤细胞的生长。因而研究抑制多胺合成的关键酶的方法就成了进来肺癌治疗的热点。鸟氨酸脱羧酶（ornithine decarboxylase,ODC）是多胺合成的第一个限速酶,已有研究表明,无论是以ODC竞争性抑制剂二氟甲基鸟氨酸（DFMO）抑制ODC活性还是以ODC为靶标采用反义核酸技术来抑制ODC在肺癌细胞中的表达,都可减少多胺在细胞的含量,从而达到抑制肺癌细胞生长的目的。但鸟氨酸脱酶（ODC）并非多胺合成中的唯一限速酶。S—腺苷甲硫氨酸脱羧酶（s-adenosylmethionine decarboxylase,SAMDC）是多胺合成的关键酶。在肿瘤细胞中S—腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因表达含量亦明显增高。有研究显示单纯抑制ODC的表达只能有效的腐胺水平,SAMDC的活性却呈反馈性升高,精胺的浓度也相应升高,因而不能很好的抑制多胺的生成。因此认为,如果同时抑制ODC和SAMDC在肿瘤细胞中的表达才能有效降低肿瘤细胞中多胺含量,从而对抑制肿瘤细胞的生长起到关键作用。另一方面,虽然利用ODC的抑制物二氟甲基鸟氨酸（DFMO）还是SAMDC的抑制物MGBC和SAM486A等,均能竞争性抑制ODC与SAMDC的生物活性,但其化学性质不稳定,非特异性的毒副作用大,不适合临床应用治疗。因此,研究利用基因技术来抑制肺癌细胞中ODC与SAMDC的表达生成及活性迫在眉睫。我们选择肺癌为目标,利用腺病毒同时转导ODC基因与AdoMetDC基因的双反义RNA对肺癌细胞的抑制作用,为进一步研究肺癌基因治疗的方法提供理论依据和技术对策。【研究方法】①构建鸟氨酸脱羧酶（ODC）和S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶（AdoMetDC）双反义RNA腺病毒载体。②体外基因转染效率的检测。采用FACS检测Ad-GFP感染细胞中GFP表达,以测定不同感染复数（MOI）的腺病毒对肺癌A-549细胞的基因转染效率。将肺癌A-549细胞,按3×10^-5个细胞/孔铺于六孔板中。吸出细胞培养液加入500μlAd-GFP病毒孵育液,感染复数分别100、50、20、10、5和0。吸出病毒孵育液,加入完全培养基2ml,放入细胞培养箱继续培养48h。用流式细胞仪计数GFP阳性细胞及细胞总数。③应用MTT法实验观察Ad-ODC-AdoMetDCas对肺癌A-549细胞生长增殖的影响。测定被不同感染复数重组腺病毒Ad-ODC-AdoMetDCas感染细胞的增殖程度,并绘制不同感染细胞的生长曲线。④采用Western印迹检测肺癌A-549细胞转染腺病毒（Ad-ODC-AdoMetDCas）后,其ODC和AdoMetDC蛋白表达的量。将肺癌A-549细胞分别感染50 MOI的Ad-GFP,Ad-ODCas和Ad-ODC-AdoMetDCas 72 h后收集细胞。用裂解液抽提细胞总蛋白。蛋白样品浓度采用BCA法测定。⑤采用HPLC法检测肺癌A-549细胞转染腺病毒（Ad-ODC-AdoMetDCas）后,其多胺的含量。收集10⁷个细胞,用PBS冲洗两遍后离心。将高氯酸加入到细胞沉淀中离心,取上清液。用HPLC系统测定多胺的含量。⑥应用TUNEL标记检测法观察Ad-ODC-AdoMetDCas对肺癌细胞凋亡的影响。腺病毒Ad-ODC-AdoMetDCas,Ad-ODCas和Ad-GFP分别以50MOI感染A-549细胞后,用TUNEL试剂盒检测细胞凋亡情况。【研究结果】①基因转染效率实验结果显示,以50MOI的Ad-GFP感染肺癌细胞48h后,大约有75%肺癌A-549细胞GFP表达阳性,但不会引起细胞毒性（图1）。②重组腺病毒Ad-ODC-AdoMetDCas对肺癌细胞A-549有剂量依赖性的抑制作用（图2）,根据实验结果挑选A-549细胞的感染滴度为50MOI。正常情况下A-549细胞生长迅速,而感染Ad-ODC-AdoMetDCas后细胞生长明显减慢,细胞生长曲线更趋低平（图3）,最大生长抑制率可达70%,而无明显细胞毒性。③采用Western印迹法显示以Ad-ODC-AdoMetDCas感染肺癌A-549细胞,可明显抑制肺癌细胞中ODC和AdoMetDC基因表达,基因抑制率大于60%（p＜0.05）,ODC和AdoMetDC含量明显减少。④HPLC结果显示,肺癌A-549细胞感染Ad-ODC-AdoMetDCas后,细胞内三种多胺含量都明显降低（p＜0.05）。⑤TUNEL标记检测结果证实,Ad-ODC-AdoMetDCas可引起肺癌A-549细胞明显凋亡。【研究结论】本研究结果表明以ODC和AdoMetDC为靶标的反义腺病毒载体可以降低肺癌细胞内多胺含量,能减少ODC和AdoMetDC基因的表达,减少肺癌细胞中的多胺的含量从而了抑制肺癌细胞的体外生长和增殖,并诱导细胞凋亡。

全文目录

中文摘要  6-9
英文摘要  9-12
符号说明  12-14
前言  14-17
实验第一部分构建人ODC、AdoMetDC双反义腺病毒载体  17-26
  材料  17-19
  方法  19-26
实验第二部分人ODC、AdoMetDC双反义腺病毒对肺癌A-549细胞抑制实验的研究  26-30
  材料  26-27
  方法  27-30
结果  30-31
讨论  31-38
结论  38-39
图片  39-42
参考文献  42-47
综述  47-59
  参考文献  55-59
致谢  59-60
攻读学位期间发表的学术论文目录  60-61
学位论文评阅及答辩情况表  61

腺病毒介导的鸟氨酸脱羧酶和S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶双反义RNA抑制肺癌A-549细胞的实验研究

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