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瘦素对三维培养大鼠关节软骨细胞活性及其相关基因（Aggrecan、TGF-β1）表达的影响

作　者: 张磊
导　师: 赵文国
学　校: 华北煤炭医学院
专　业: 外科学
关键词: 瘦素关节软骨 Col-Ⅱ aggrecan TGF-β1
分类号: R684
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 38次
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内容摘要

瘦素首次证明存在时在1994年美国洛克菲勒大学实验室利用位点克隆技术分别克隆小鼠和人类的同源序列(ob基因)而证实的[1],并证明了其基因、分子结构及其生理作用。瘦素主要由白色脂肪产生,但是其他组织也可以产生,例如软骨、骨、棕色脂肪等等。近年来人们对瘦素的研究涉及许多领域,发现其与很多疾病多有关联,这些疾病包括肥胖、糖尿病、骨质疏松等等[2]。尤其发现,在软骨内成骨的过程中,瘦素也起着一定的作用[3],可能通过促进软骨细胞的增殖使得生长板增高,而最终使得长骨增长。有研究证实[4、5]人类关节软骨细胞表面存在瘦素受体,并且瘦素可以增加成年小鼠关节软骨的厚度。瘦素在骨性关节炎的发病中也有一定的作用,有人发现骨性关节炎病人关节液中含有瘦素,并且与关节炎的严重程度成正比,但是关于两者之间具体的影响关系还需要进一步研究证实[6]。关节软骨为覆盖关节面的一层光亮的低摩擦、富有弹性、高渗透性的特异化结缔组织,主要由软骨细胞和细胞基质构成,其功能是传导及分布载荷、维持和承受关节面的接触应力。关节软骨是无血管、淋巴管和神经的组织,所以自我修复能力相当有限,轻微伤害就有可能导致渐进式的损伤[7]。正是如此,许多年来软骨损伤修复一直是临床和基础研究的重点、难点。现如今人们研究出许多方法来修复受损的软骨,如用支架代替受损区域、用一些药物促进软骨组织的重建等等,虽然取得了一些效果,但是由于种种原因而不能普及治疗。软骨组织内含有多种生长因子并分泌一些基质成分,主要包括转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor, IGF)、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)、II型胶原(type II collagen)、蛋白多糖(aggrecan)等,它们通过自分泌、旁分泌等方式,共同作用于软骨细胞分裂、生长、成熟、老化的各个阶段。我们先前实验已经研究了平面培养的软骨细胞在不同浓度瘦素干预下无论是细胞的活性、II型胶原的分泌还是TGF-β1、IGF-I表达量均较空白组明显增加;但体外三维立体条件下,瘦素对软骨细胞干预情况还未做研究。本实验旨在体外三维环境中研究瘦素对软骨细胞干预情况,为将来软骨细胞回植体内、临床修复软骨损伤提供借鉴。目的本实验旨在研究瘦素对体外三维培养大鼠关节软骨细胞的活性、增殖、细胞表型及功能的影响,并探讨其对软骨修复及基质降解相关的关键基因col-II、aggrecan、TGF-β1表达的影响,从而以得出的结果来更好的指导临床关于软骨组织修复及软骨组织工程学的发展。方法1取3-4周龄大鼠,处死后无菌条件下取膝关节软骨细胞,用机械法和酶消法制成细胞悬液,单层培养扩增后进行体外三维培养;2对培养的大鼠关节软骨细胞进行形态观察及鉴定;3试验分组:按试验方法分为两组单纯三维条件下培养的软骨细胞,瘦素(浓度为10ng/ml)作用条件下三维培养的软骨细胞;4用MTT法及流式细胞仪测定软骨细胞经瘦素刺激不同时间的细胞增殖情况;5采用PCR法检测软骨细胞经瘦素刺激不同时间表达TGF-β1、aggrecan的情况;6用SPSS13.0软件对结果进行统计学分析。结果1采用细胞体外培养方法成功培养出大鼠关节软骨细胞,并通过形态观察和特殊染色得到证实。2瘦素组细胞增殖明显高于空白组,最佳作用时间为作用24h时,继续瘦素刺激细胞增殖不明显,并有抑制作用的趋势。3瘦素组aggrecan、TGF-β1基因表达明显高于空白组,最佳时间为作用24h时。结论1与空白组对比,瘦素组可以显著提高软骨细胞的活性;2与空白组对比,瘦素组可促进体外三维培养大鼠关节软骨细胞增殖3与空白组对比,瘦素可加强TGF-β1 mRNA表达,以防止细胞外基质降解,有修复软骨的潜能。4与空白组对比,瘦素可加强aggrecan mRNA表达,可促进细胞外基质的生成,给软骨细胞提供良好的生存环境。

全文目录

摘要  3-6
Abstract  6-9
英文缩略词表  9-10
研究论文瘦素对三维培养大鼠关节软骨细胞活性及其相关基因（Aggrecan、TGF-β1）表达的影响  10-39
  前言  10-12
  材料与方法  12-25
  结果  25-29
  讨论  29-34
  小结  34-35
  参考文献  35-39
附图  39-44
综述一软骨修复现状的相关研究  44-50
  参考文献  48-50
致谢  50-51
个人简历  51

瘦素对三维培养大鼠关节软骨细胞活性及其相关基因（Aggrecan、TGF-β1）表达的影响

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