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RAS功能异常在高糖引起的肾小管上皮细胞转分化中的作用及机制研究

作　者: 周莉
导　师: 陆利民
学　校: 复旦大学
专　业: 生理学
关键词: 糖尿病肾病上皮细胞转分化肾素-血管紧张素系统 MAPK TGF-β1 miR-181a
分类号: R692.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

糖尿病肾病(Diabetic nephropathy, DN)是糖尿病最严重的并发症之一,也是临床终末期肾病(end-stage renal disease, ESRD)发病最主要的原因,研究显示有40%Ⅰ型糖尿病和15%Ⅱ型糖尿病患者可并发肾脏损害,并最终引起肾功能衰竭。DN早期病理学特征性改变为肾小球肥大、细胞外基质(extracellular matrix,ECM)过度沉积,基底膜增厚,晚期发展为肾小球硬化和肾小管间质弥漫性纤维化。糖尿病肾病发病原因复杂,至今其发生的细胞与分子机制尚未完全阐明,但随着研究的深入,学者们普遍认为肾间质的纤维化是包括糖尿病肾病在内的各种慢性肾脏疾病进展到终末期肾病的共同病理基础,研究肾小管间质纤维化的发生机制,能为临床防治DN,延缓慢性肾损害提供新的思路和方法。肾小管间质纤维化形成的主要原因包括肾脏成纤维细胞活化和肾小管上皮细胞发生转分化(epithelial mesenchymal transition, EMT),最终使肾脏细胞外基质合成增多,降解减少,导致细胞间基质过度沉积。成熟的肾小管上皮细胞虽然是终末分化细胞,但越来越多的研究表明,在各种病理状态下,肾小管上皮细胞具有向肌样成纤维细胞转分化的能力；而转分化后的肌样成纤维细胞能够向间质区浸润、迁移,获得细胞增殖能力,细胞外基质合成及分泌增强,参与肾脏间质纤维化的过程。EMT被认为是肾间质纤维化发生发展的始动因素之一,揭示EMT发生机制是当前肾脏研究新的热点,多种致肾损害的因素,包括糖尿病均证实可引起EMT。肾素—血管紧张素系统(RAS)在机体心血管系统、水盐平衡及细胞功能调节中有重要作用。大量的基础实验和临床研究均证实,高糖状态下RAS的过度激活在糖尿病肾病发病中发挥着十分重要的作用。近年来,随着多个RAS新成员被相继发现,RAS在概念有了重大更新,在新的RAS中,除传统的ACE-AngⅡ-AT1通路外,还存在与之相平行的ACE2-Ang-(1-7)-Mas通路。在心血管等的研究中发现,RAS两条通路在功能上相互拮抗,Ang-(1-7)产生与AngⅡ相拮抗的生物学效应。在本课题中,我们就高糖状态下肾脏局部RAS的变化,RAS改变与EMT的关系以及高糖导致RAS改变的发生机制等问题进行了研究,力图阐明糖尿病时EMT发生机制。第一部分：高糖状态下肾小管上皮细胞RAS ACE-AngⅡ-AT1通路的改变及在EMT中的作用研究：实验在离体培养的大鼠肾小管上皮细胞株(NRK-52E)上进行,用免疫荧光细胞化学方法观察肾小管上皮转分化的标记蛋白,用Western blot方法定量分析肌样细胞标记蛋白(α-SMA)和上皮细胞标记蛋白(E-cadherin)的水平；用Real-timePCR的方法检测AGT、ACE、AT1 mRNA水平,用酶联免疫分析法(ELISA)检测细胞培液中AngⅡ的浓度。实验结果显示：肾小管上皮细胞给予30 mmol/L D-glucose刺激48-72 hrs,细胞形态发生明显改变,由卵圆形铺路石样转变成长梭形；细胞免疫荧光染色显示,肌样细胞标记蛋白α-SMA表达明显增强,而上皮细胞标记蛋白E-cadherin表达减少；Western blot实验结果同样证实,肾小管上皮细胞在高糖环境下α-SMA蛋白表达增多、E-cadherin蛋白表达减少；此外,Real-time PCR结果显示,细胞在高糖环境下分别培养24和48 hrs后,细胞中AG1、ACE、AT1 mRNA水平明显增加,培液中AngⅡ水平明显升高。上述结果提示：高糖刺激能够引起肾脏小管上皮细胞发生转分化,同时,细胞局部RAS系统功能异常,RAS中ACE-AngⅡ-AT1轴功能增强。在此基础上,我们进一步对病理状态下ACE-AngⅡ-AT1轴的改变是否参与肾小管上皮细胞转分化进行了研究。结果显示：一、高糖状态下ACE-AngⅡ-AT1轴的改变参与肾小管上皮细胞转分化实验用10-5-10-7 mol/L浓度的ATl受体阻断剂Losartan预处理细胞30min,然后给予细胞高糖刺激48 hrs,用细胞免疫荧光染色和Western Blot方法观察转分化标记蛋白E-cadherin和Vimentin的表达。实验结果显示,高糖刺激48 hrs可引起肾小管上皮细胞中上皮细胞标志蛋白E-cadherin表达减少,同时,肌样成纤维细胞标志蛋白Vimentin表达增加；Losartan能够浓度依赖性地逆转高糖引起的转分化标记蛋白的改变；单独给予10-5mol/L的Losartan对E-cadherin和Vimentin蛋白表达没有显著影响。二、观察Losartan抑制高糖刺激引起的肾小管上皮细胞TGF-β1合成增加细胞预先给予10-5mol/L浓度的Losartan,然后高糖培养48 hrs,结果显示(30mM)葡萄糖使肾小管上皮细胞TGF-β1合成增加,Losartan能够明显抑制上述效应,但不能完全阻断高糖引起的TGF-β1合成增加。三、观察Losartan抑制高糖刺激引起的肾小管上皮细胞细胞外基质蛋白合成增加细胞用10-5-10-7mol/L浓度的Losartan预处理细胞30 min,然后在高糖状态下培养48 hrs,用Western Blot方法观察细胞外基质蛋白Fibronectin和MMP-9的蛋白水平。实验结果显示,高糖刺激48 hrs后,细胞合成Fibronectin和MMP-9增加,Losartan能剂量依赖性地抑制高糖引起的Fibronectin和MMP-9合成增加,但即使高浓度Losartan (10-5 mol/L)也不能完全阻断Fibronectin合成增加；在正常培养的细胞中,单独给予10-5mol/L浓度的Losartan时,对细胞合成Fibronectin和MMP-9并无显著影响。第二部分：由于AT1受体的阻断剂Losartan只能部分逆转高糖引起的EMT及其细胞转分化后的功能改变,本课题中,我们进一步对RAS中新发现ACE2-Ang(1-7)-Mas轴的改变和是否也参与高糖引起的EMT进行了研究。结果显示：一、高糖刺激导致ACE2-Ang(1-7)-Mas通路明显下调。分别给予细胞高糖刺激24或48 hrs, Real-time PCR结果显示,ACE2 mRNA水平较对照组均有明显降低；Mas受体mRNA水平在高糖刺激24 hrs后虽有下降,但无统计学显著性,而在高糖刺激48 hrs后,也有明显降低。二、ACE2-Ang(1-7)-Mas代谢通路的改变参与高糖刺激引起肾小管上皮细胞转分化过程。高糖刺激诱导培养的肾小管上皮细胞E-cadherin蛋白表达减少和Vimentin蛋白表达增加,给予不同浓度的Ang-(1-7)(10"5-10-7M)能够浓度依赖性地逆转高糖刺激引起的EMT标记蛋白的改变。同时,免疫荧光实验证实10-5M浓度的Ang-(1-7)能够明显抑制高糖刺激所引起的a-SMA表达的增强。三、Ang-(1-7)能逆转高糖刺激引起的MAPKs通路中ERK1/2和p38的磷酸化水平升高,但对高糖引起的JNK磷酸化水平升高无显著影响。细胞在高糖环境下培养不同时间(15,30,60min)后,MAPK家族(ERK,p38,JJNK)磷酸化水平均有显著升高,在高糖刺激60min后,细胞MAPK中三条通路仍处于高磷酸化状态；给予Ang-(1-7)(10-5 M)能抑制高糖引起的ERK1/2和p38的磷酸化水平升高,但对高糖引起的JNK磷酸化水平升高无显著影响；在正常培养细胞中,单独给予Ang-(1-7)并不明显改变MAPK三条通路的磷酸化水平。四、Ang-(1-7)抑制高糖刺激引起的肾小管上皮细胞TGF-β1合成及分泌的增加。给予10-5 M浓度的Ang-(1-7)能抑制高糖引起的肾小管上皮细胞中TGF-β1 mRNA水平的升高,以及细胞培液中TGF-β1水平的升高,该抑制效应能被Ang-(1-7)的特异性受体Mas受体阻断剂A-779所阻断。单独给予Ang-(1-7)或A-779对细胞合成和分泌TGF-β1均无明显的作用。TGF-β1的产生与高糖引起的MAPK通路的激活有关,实验中,我们进一步观察MAPK三条通路在高糖引起TGF-β1合成增加中的作用,实验结果显示,单独给予PD98059 (ERK1/2 inhibitor), SB203580 (p38 inhibitor)或SP600125 (JNK inhibitor)均能部分抑制高糖诱导的TGF-β1的产生,三种阻断剂联合使用能完全逆转高糖引起的TGF-β1生成增加。五、Ang-(1-7)抑制高糖刺激引起的肾小管上皮细胞ECM合成增加Western blot结果显示,高糖刺激48小时后,细胞外基质Fibronectin合成明显增加,给予10-5M浓度的Ang-(1-7)能部分抑制高糖引起的细胞Fibronectin蛋白合成的增加,而10。M浓度的Ang-(1-7)不能影响细胞Fibronectin的合成。第三部分：体内RAS功能异常参与糖尿病肾肾病发生已受到广泛关注,我们上述实验研究证实,在高糖条件下细胞局部RAS异常,包括ACE-AngⅡ-AT1通路被激活,ACE2-Ang(1-7)-Mas通路受到抑制均与EMT发生有关,然而,高糖刺激导致RAS系统的功能异常的具体机制还不清楚。nicroRNAs参与基因表达调控,是体内重要的转录后调控机制。我们通过对高糖刺激前后差异表达microRNAs的筛选,来研究高糖导致小管上皮细胞上RAS系统重要成员表达改变的发生机制。一、高糖刺激后细胞差异表达microRNAs的筛查：实验分为三组：正常葡萄糖组、甘露醇对照组和高葡萄糖组,肾小管上皮细胞株(NRK-52E)培养24-48 hrs,抽提细胞RNA,随后进行microarray分析,结果显示microRNA-181a在高糖条件下表达明显上调,通过生物信息学分析,显示Mas受体可能是miR-181a体内调控的靶基因之一。二、用Real-time PCR的方法验证microRNA-181a的差异表达：细胞在高糖环境下培养24 hrs, Real-time PCR结果显示,miR-181a水平较正常组(NG)明显升高,结果与芯片筛查结果一致,同时,在STZ诱导糖尿病发病3周的大鼠肾组织中,同样观察到miR-181a水平较正常大鼠有明显升高。三、microRNA-181a对Mas受体表达调控的验证：设计miR-181a knockdown探针,经脂质体介导转染正常培养的小管上皮细胞,结果显示转染miR-181a knockdown探针24 hrs后,细胞中miR-181a水平明显下调,而转染随机序列的scramble探针并不影响细胞1miR-181a水平,提示miR-181a knockdown探针能特异性干扰miR-181a表达。进一步观察转染miR-181a knockdown探针对Mas受体表达的影响,实验结果显示,正常葡萄糖浓度培养的细胞,转染miR-181a knockdown探针后,Mas受体mRNA水平较空白对照组明显升高；高糖状态下,细胞Mas受体mRNA水平降低,而转染miR-181a knockdown探针后,Mas受体mRNA水平明显升高,证实Mas受体是miR-181a体内调控的靶基因之一。综上所述,本课题研究结果证实：1、高糖能诱导体外培养的肾小管上皮细胞发生转分化,转分化的细胞分泌ECM能力增强,该作用在体内能促进肾脏的纤维化发生。局部ACE-AngⅡ-AT1通路的激活参与了该过程,AngⅡ通过作用于ATl受体,刺激TGF-β1合成及分泌,引起EMT发生,然而,ATl受体阻断剂Losartan只能部分逆转高糖引起的EMT。2、高糖状态下,与ACE-AngⅡ-AT1通路在功能上相拮抗的ACE2-Ang-(1-7)-Mas代谢轴也受到抑制,ACE2-Ang-(1-7)-Mas通路功能降低也参与高糖引起的EMT,给予Mas受体激动剂Ang-(1-7)能在一定程度上抑制高糖引起的EMT, Ang-(1-7)激活Mas受体后能抑制高糖引起ERK和p38的磷酸化。3、在STZ诱导的糖尿病发病早期动物模型及高糖刺激的小管上皮细胞中均观察到miR-181a水平显著升高,在本课题中,用microRNAs干扰技术证实,Mas受体是miR-181a体内调控的靶基因之一,高糖状态下miR-181a水平升高与ACE2-Ang-(1-7)-Mas通路功能降低有关。

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