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嗅鞘细胞培养液对神经样细胞RhoA活性和轴突生长的影响

作　者: 张俊
导　师: 刘锦波
学　校: 南京医科大学
专　业: 骨外科
关键词: 嗅鞘细胞 PC12细胞 RhoA蛋白 神经丝蛋白 synapsin synaptophysin
分类号: R651.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


研究目的:观察嗅鞘细胞培养液(olfactory ensheathing cells culture medium,OECCM)对神经样细胞PC12细胞活性RhoA的表达和轴突生长的影响,探讨嗅鞘细胞促进脊髓轴突生长与RhoA/ROCK信号通路的关系。研究方法:(1)原代嗅鞘细胞培养并纯化,鉴定,收集培养上清制备成OECCM。(2)PC12细胞株培养,经OECCM和或RhoA激活剂LPA作用后,用Western blotting方法检测活性RhoA水平。(3)PC12细胞株培养,加入OECCM后观察细胞形态学变化。(4)PC12细胞株培养,经OECCM和或RhoA激活剂LPA作用后,用免疫荧光法观测RhoA吸光度(A)值的变化。(5)PC12细胞株培养,经OECCM和或RhoA激活剂LPA作用后,细胞用鬼笔环肽进行染色,并在荧光显微镜下观察应激纤维的形成变化。(6)PC12细胞株培养,经OECCM作用后,用免疫荧光法检测神经丝蛋白(neurofilament protein , NF)的表达及分布。(7)PC12细胞株培养,经OECCM作用后,用Western blotting方法检测神经丝蛋白、突触蛋白和突触素蛋白的相对含量。研究结果:(1)培养的嗅鞘细胞呈双极、三极和多极,胞体较小,立体感强,折光性好,细胞突起相互交织成网状结构,嗅鞘细胞的纯度在85%以上。(2)嗅鞘细胞培养液可抑制RhoA活性,并能拮抗LPA引起的活性RhoA增高。(3)在PC12细胞株中,经OECCM作用后,细胞长有长短不一突起,并随着时间的延长交织成网。(4)在PC12细胞株中,经OECCM和或RhoA激活剂LPA作用后,免疫荧光显示OECCM作用组RhoA吸光度(A)值明显低于对照组,而LPA组中则明显增高。(5)嗅鞘细胞培养液对LPA引起的应激纤维形成有抑制作用。(6)在PC12细胞株中,经OECCM作用后,神经丝蛋白的分布范围逐渐增加,其分布面积与β-tubulin分布面积的比值较对照组显著增高。(7)在PC12细胞株中,经OECCM作用后,神经丝蛋白、突触蛋白和突触素蛋白的表达显著高于对照组。结论:嗅鞘细胞培养液可促进神经样细胞PC12细胞轴突生长,在结构和功能上向神经元分化,并在此过程中抑制了RhoA活性,表明嗅鞘细胞促神经轴突生长机制可能通过RhoA/ROCK信号通路。

全文目录


中文摘要  6-8
英文摘要  8-10
第一章 前言  10-18
  1.1 RhoA介导的信号通路在嗅鞘细胞促神经轴突生长中的作用  10-15
    1.1.1 嗅鞘细胞的特性  10-11
    1.1.2 RhoA的研究背景  11-13
    1.1.3 RhoA信号通路与轴突生长抑制的关系  13-15
    1.1.4 嗅鞘细胞促轴突生长与RhoA的研究  15
  1.2 本论文研究的目的、意义、方法、实验方案的设计  15-18
    1.2.1 研究目的  15
    1.2.2 研究意义  15
    1.2.3 研究方法及技术  15
    1.2.4 实验方案的设计  15-18
第二章 嗅鞘细胞原代培养、鉴定及培养上清的制备  18-24
  2.1 材料和方法  18-20
    2.1.1 材料  18-19
    2.1.2 方法  19-20
  2.2 实验结果  20-22
    2.2.1 嗅鞘细胞形态学观察  20-22
    2.2.2 免疫细胞化学特征及纯度测定  22
  2.3 讨论  22-24
第三章 嗅鞘细胞培养液对RhoA活性的影响  24-34
  3.1 材料与方法  24-28
    3.1.1 材料  24-27
    3.1.2 方法  27-28
  3.2 实验结果  28-31
    3.2.1 嗅鞘细胞培养液对RhoA活性的抑制作用  28-31
  3.3 讨论  31-34
第四章 嗅鞘细胞培养液抑制RhoA相关生物学效应的作用  34-42
  4.1 材料和方法  34-35
    4.1.1 材料  34
    4.1.2 方法  34-35
  4.2 实验结果  35-40
    4.2.1 嗅鞘细胞培养液对PC12细胞形态的影响  35-36
    4.2.2 嗅鞘细胞培养液对PC12细胞RhoA的表达影响  36-37
    4.2.3 嗅鞘细胞培养液对细胞骨架形成的影响  37-40
  4.3 讨论  40-42
第五章 嗅鞘细胞培养液对PC12细胞分化的作用  42-50
  5.1 材料和方法  42-44
    5.1.1 材料  42
    5.1.2 方法  42-44
  5.2 实验结果  44-49
    5.2.1 免疫荧光法检测NF的表达增加  44-45
    5.2.2 蛋白质印迹法检测NF、synapsin、synaptophysin的表达增加  45-49
  5.3 讨论  49-50
第六章 主要结论和展望  50-52
  6.1 主要结论  50
  6.2 展望  50-52
参考文献  52-58
文献综述  58-66
  参考文献  63-66
附录  66-68
攻读硕士学位期间发表的文章  68-70
致谢  70

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中图分类: > 医药、卫生 > 外科学 > 外科学各论 > 头部及神经外科学 > 脊髓
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