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组织因子人—鼠嵌合抗体制备的研究

作　者: 张全爱
导　师: 杨素萍；赵邑
学　校: 山西大学
专　业: 微生物学
关键词: TF 凝血因子Ⅲ 嵌合抗体真核细胞基因工程抗体
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

组织因子(tissue factor, TF)是相对分子量为47 kD的跨膜糖蛋白,在调节凝血功能方面有重要的作用,近年来研究发现TF参与动脉粥样硬化的发生发展、血管生成和肿瘤生长等非凝血功能。利用TF单克隆抗体的导向性和特异性,抑制TF的活性,从而抑制肿瘤的生长。由于鼠源性抗体药物对人类具有免疫原性,其广泛的临床应用受到极大限制,而采用基因工程技术对鼠源性抗体进行人源化改造是治疗用抗体的重要手段。因此,本文在自行研制的抗人TF鼠源性单克隆抗体的基础上,利用基因工程抗体技术,成功构建了抗人TF人-鼠嵌合抗体基因的真核共表达质粒。将其转染CHO-K1细胞,筛选获得能分泌表达TF嵌合抗体的CHO稳定细胞株(JJ3),经Protein A亲和层析柱纯化获得高纯度的抗TF嵌合抗体,体外分析该抗体具有抗凝血活性和对K562和HL-60癌细胞生长具有明显的抑制作用,为TF抗体治疗的临床应用奠定基础。首先利用RNA提取试剂盒,从分泌TF鼠源性抗体的杂交瘤细胞(mTA)中提取总RNA,以鼠源性TF单克隆抗体重链可变区(VH)及轻链可变区(VL)基因序列设计特异性引物,采用RT-PCR获得重链和轻链可变区目的基因。将目的基因分别与pCN40表达载体连接,构建成重组质粒pCN40-VL-VH。经AgeⅠ、BstBⅠ和HpaⅠ、EcoRⅠ分别对重组质粒酶切鉴定和琼脂糖凝胶电泳分析,两条目的基因片段大小约为300 bp,与理论值(321 bp、351 bp)相吻合,测序分析其序列与目的基因序列一致,表明已成功构建了抗人TF人-鼠嵌合抗体重组质粒pCN40-VL-VH。其次,以中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)为宿主细胞,采用中量无内毒素提取质粒试剂盒提取重组质粒pCN40-VL-VH,阳离子脂质体方法转染CHO-K1细胞,经G418硫酸盐(800μg/mL)筛选,并通过有限稀释法克隆化培养,培养上清经间接ELISA检测。对筛选的分泌抗体阳性细胞株培养上清经间接ELISA、Western blot方法分析,获得了转染重组质粒pCN40-VL-VH的CHO细胞株(JJ3),并能稳定地分泌抗人TF人-鼠嵌合抗体。利用rProtein A亲和层析柱纯化该细胞培养上清中的抗体,纯化后的产品经紫外分光光度计定量分析抗体产量约为50 mg/L。经SDS-PAGE分析：纯化嵌合抗体的重链和轻链的分子量分别约为50 kD和26 kD,纯度达到97%以上。最后,选择K562、HL-60、LOVO、BEL-7402人肿瘤细胞株,采用MTT法,体外研究了该纯化抗体对肿瘤细胞增殖的影响。结果表明：在一定浓度范围内,该抗体能够明显地抑制K562和HL-60细胞的生长,最大抑制率分别为35%和64.9%,且呈剂量效应关系,而对LOVO和BEL-7402细胞生长没有明显的影响。不同浓度的嵌合抗体与27.4μg/mL的TF温育1.5 h,经脂化和凝血酶原时间测定,表明随着嵌合抗体浓度的升高,与对照组相比,正常人血浆的PT显著延长(P<0.01)。上述结果表明：本研究构建了抗人TF人-鼠嵌合抗体重组质粒pCN40-VL-VH,转染宿主细胞并获得能够稳定表达抗人TF人-鼠嵌合抗体的CHO-K1细胞株(JJ3),经亲和层析获得纯度达97%以上的抗人TF人-鼠嵌合抗体,体外实验表明该抗体具有抗凝活性和有效地抑制K562和HL-60细胞增殖的活性。

全文目录

中文摘要  10-12
ABSTRACT  12-15
第一章综述  15-23
  1 组织因子的分子结构及生物学功能  15-18
    1.1 TF的分子结构  15-16
    1.2 TF的生物学功能  16-18
  2 基因工程抗体概述  18-21
    2.1 基因工程抗体的发展概括  18-19
    2.2 人源化单克隆抗体改造  19-21
  3 抗体药物的研究进展  21
  4 CHO细胞表达系统  21-22
  5 本文的研究内容、目的及意义  22-23
第二章组织因子(TF)人-鼠嵌合抗体表达载体的构建  23-33
  1 材料  23-24
    1.1 主要仪器  23
    1.2 工具酶及主要试剂  23-24
    1.3 细胞株、菌株、质粒和培养基  24
  2 方法  24-28
    2.1 克隆TF单克隆抗体可变区基因  24-25
    2.2 重组质粒pMD19-T-V_L、pMD19-T-V_H的构建及鉴定  25-26
    2.3 重组质粒pCN40-V_L-V_H的构建及鉴定  26-28
  3 实验结果  28-31
    3.1 V_H和V_L基因的RT-PCR扩增和鉴定  28
    3.2 VL和VH基因重组质粒pMD19-T-V_L、pMD19-T-V_H构建和鉴定  28-29
    3.3 重组质粒pCN40-V_L-V_H构建和鉴定  29-31
  4 讨论  31-33
第三章组织因子人-鼠嵌合抗体在CHO细胞中表达及纯化  33-44
  1 材料  33-34
    1.1 细胞株与质粒  33
    1.2 主要化学试剂  33
    1.3 转染试剂  33-34
    1.4 免疫分析试剂  34
    1.5 主要仪器  34
  2 方法  34-38
    2.1 CHO-K1真核表达细胞株的复苏  34
    2.2 TF嵌合抗体表达载体pCN40-V_L-V_H的纯度分析和含量测定  34-35
    2.3 TF嵌合抗体在CHO细胞中稳定表达  35-36
    2.4 CHO转染细胞阳性克隆和培养上清中抗体的含量测定  36
    2.5 细胞培养上清中嵌合抗体的鉴定  36
    2.6 阳性细胞生长曲线的绘制  36
    2.7 阳性细胞中目的基因PCR鉴定。..  36-37
    2.8 重组Protein A(rProtein A)亲和柱纯化TF嵌合抗体  37
    2.9 嵌合抗体重链和轻链分子量和纯度检测  37-38
  3 实验结果  38-42
    3.1 嵌合抗体重组质粒纯度和含量的测定  38
    3.2 获得嵌合抗体稳定细胞株  38
    3.3 嵌合抗体阳性细胞培养上清中抗体表达量的测定  38-39
    3.4 嵌合抗体的Western blot检测  39
    3.5 细胞生长曲线  39
    3.6 TF嵌合抗体转染细胞中目的基因的鉴定  39-41
    3.7 嵌合抗体的纯化和定量  41-42
    3.8 蛋白电泳后检测TF人-鼠嵌合抗体  42
  4 讨论  42-44
第四章抗人TF人-鼠嵌合抗体生物活性  44-50
  1 材料  44
    1.1 细胞株  44
    1.2 主要试剂  44
    1.3 主要仪器  44
  2 方法  44-45
    2.1 TF人-鼠嵌合抗体对四种癌细胞增值抑制作用分析  44-45
    2.2 TF人-鼠嵌合抗体抗促凝活性的分析  45
    2.3 统计学分析方法  45
  3 实验结果  45-48
    3.1 TF人-鼠嵌合抗体对四种癌细胞增值抑制作用分析  45
    3.2 TF人-鼠嵌合抗体抗促凝活性的分析  45-48
  4 讨论  48-50
参考文献  50-52
结论与展望  52-53
攻读学位期间取得的研究成果  53-54
致谢  54-55
个人简况及联系方式  55-57

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