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hMIC-1抗体的研制、鉴定及胰腺癌患者血清中MIC-1升高的临床价值

作　者: 邵长君
导　师: 张伟
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 细胞生物学
关键词: MIC-1 单克隆抗体 杂交瘤 多克隆抗体 胰腺癌 CA199
分类号: R735.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


第一部分hMIC-1抗体的研制及鉴定目的:制备人巨噬细胞抑制因子-1(hMIC-1)的单克隆抗体与多克隆抗体,为建立MIC-1免疫学检测方法和功能研究奠定物质基础。方法:以酵母表达的hMIC-1重组蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,通过传统杂交瘤技术制备抗bMIC-1单克隆抗体,采用间接ELISA和Western blot等方法鉴定抗体的亚类、特异性等特性。采用免疫组织化学等常规检测方法进一步检验抗体的特异性及可能的用途。此外,将hMIC-1重组抗原经多次多点免疫新西兰大耳白兔,制备得到兔抗hMIC-1抗血清,纯化后鉴定抗体的特异性,并初步探索建立ELISA检测方法的可行性。结果:获得1株可稳定分泌抗hMIC-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为2G7。Westernblot鉴定表明2G7单抗能够特异识别重组hMIC-1及人结肠组织表达的还原型与非还原型MIC-1,与酵母粗提取物无交叉反应。应用2G7抗体免疫组化检测MIC-1在结肠癌、前列腺癌表达情况,结果表明MIC-1分布于细胞浆,呈强阳性着色,与商售MIC-1单抗相一致。应用2G7抗体的免疫组化片背景更低,显示出2G7抗体具有较好的特异性。兔抗重组hMIC-1多克隆抗体能够识别天然hmIC-1,血清抗体效价为10~5,但不能与2G7单抗配对检测hMIC-1。结论:以酵母表达的重组hMIC-1作为免疫原能够用于制备抗hMIC-1单克隆抗体杂交瘤。本研究获得了1株针对hMIC-1的单克隆抗体瘤株,产生的抗体能应用于hMIC-1 Western blot检测。第二部分胰腺癌患者血清中MIC-1升高的临床价值目的:探讨MIC-1作为新的肿瘤标志物在胰腺癌临床血清学诊断中的应用价值。方法:采用双夹心酶联免疫方法检测101例胰腺癌,10例胰腺良性病变患者及50例正常人血清中的MIC-1表达水平,并与肿瘤标记物CA199进行比较研究。结果:胰腺癌患者血清中MIC-1表达水平(1427±1056 ng/L)显著高于胰腺良性肿瘤(362±177 ng/L)和正常人血清水平(299±159ng/L)(P＜0.001)。MIC-1检测胰腺癌的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和AUC值依次为81.2%,94%,96.5%,71.2%和0.92,分别高于CA199的相应对应值72.4%,89.6%,93.4%,61.4%和0.86,与CA199联合检测的敏感性可提高至91.1%。结论:MIC-1具有成为胰腺癌临床诊断的新肿瘤标记物的价值,与CA199联合检测有助于提高对胰腺癌的诊断。

全文目录


缩略语表  7-8
第一部分摘要  8-10
  中文摘要  8-9
  英文摘要  9-10
第二部分摘要  10-12
  中文摘要  10-11
  英文摘要  11-12
第一部分:hMIC-1抗体的研制、鉴定  12-51
  前言  13-16
  实验流程  16-17
  材料与方法  17-34
    一、实验材料  17
    二、主要试剂  17-21
    三、主要仪器  21-22
    四、实验方法  22-34
      1 抗原准备  22
      2 单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立  22-31
        2.1 免疫方案  22-23
        2.2 融合前小鼠免疫效果监测  23-24
          2.2.1 筛选抗体的ELISA方法的建立  23
          2.2.2 小鼠免疫血清效价测定  23-24
        2.3 细胞融合、筛选及克隆  24-26
          2.3.1 NS1细胞的准备  24
          2.3.2 饲养层细胞的制备  24
          2.3.3 脾细胞的制备  24-25
          2.3.4 细胞融合  25
          2.3.5 融合细胞的选择性培养  25
          2.3.6 阳性杂交瘤细胞的克隆化培养  25-26
          2.3.7 杂交瘤细胞的冻存和复苏  26
        2.4 单克隆抗体的制备  26-27
          2.4.1 细胞接种  26
          2.4.2 抗体纯化  26-27
        2.5 杂交瘤细胞株及分泌的单克隆抗体的鉴定  27-30
          2.5.1 单克隆抗体免疫球蛋白类型与亚型的鉴定  27
          2.5.2 单克隆抗体腹水效价测定  27
          2.4.3 单克隆抗体特异性鉴定  27-29
          2.5.4 单克隆抗体亲和力的测定  29-30
          2.5.5 单克隆抗体抗原结合位点测定  30
          2.5.6 单克隆抗体稳定性实验  30
        2.6 免疫组化化学方法  30-31
      3 hMIC-1兔多克隆抗体的制备  31-34
        3.1 实验动物  31
        3.2 免疫方案  31-32
          3.2.1 抗原乳剂的制备  31-32
          3.2.2 免疫途径、剂量和免疫周期  32
        3.3 血清抗体效价的检测  32-33
          3.3.1 双向免疫扩散法  32
          3.3.2 ELISA法  32-33
        3.4 抗血清的纯化  33
        3.5 兔多抗特异性的测定  33-34
        3.6 夹心ELISA方法的建立  34
          3.6.1 抗体的生物素化标记  34
          3.6.2 夹心ELISA方法的建立  34
  结果  34-43
    1 小鼠免疫血清效价及特异性检测  34-35
    2 细胞融合、筛选及克隆  35-36
    3 2G7抗体制备与纯化  36-37
    4 单抗鉴定  37-41
      4.1 抗体亚型测定  37
      4.2 2G7抗体特异性鉴定  37-38
      4.3 单克隆抗体亲和力的测定  38-39
        4.3.1 包被抗原及酶标抗体浓度的选择  38
        4.3.2 亲和力测定  38-39
      4.4 单克隆抗体稳定性的测定  39-40
        4.4.1 酸碱稳定性  39
        4.4.2 热稳定性  39-40
        4.4.3 杂交瘤细胞稳定性鉴定  40
      4.5 单抗相加实验  40
      4.6 2G7抗体在免疫组织化学中的应用  40-41
    5 hMIC-1兔多克隆抗体的制备与鉴定  41-43
      5.1 血清抗体效价的检测及抗体纯化  41-42
      5.2 免多抗特异性的测定  42-43
      5.3 夹心ELISA法的建立  43
  讨论  43-46
  结论  46-47
  参考文献  47-51
第二部分 胰腺癌患者血清中MIC-1升高的临床价值  51-62
  前言  52
  材料和方法  52-55
    一 实验材料  52-54
      1 样本采集  52
      2 病例资料  52-53
      3 主要试剂  53
      4主要仪器  53
      5主要溶液的配制  53-54
    二 实验方法  54-55
  结果  55-57
    1 胰腺癌患者血清中MIC-1表达水平  55
    2 MIC-1与CA199在胰腺癌临床诊断中的比较  55-56
    3 胰腺癌患者血清中MIC-1表达水平与胰腺癌临床病理各参数的相关性分析  56-57
  讨论  57-59
  结论  59-60
  参考文献  60-62
综述  62-77
  参考文献  70-77
致谢  77

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 胰腺肿瘤
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