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大鼠睾丸特异表达基因Ube1的分离鉴定及生物学特征研究

作　者: 杜颖
导　师: 贾孟春；王介东；于和鸣；谷翊群
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 泛素激活酶精子发生抑制性消减杂交 cDNA快速扩增逆转录-聚合酶链反应荧光定量PCR
分类号: Q953
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

精子发生是一个十分复杂但又高度有序的细胞分化过程,是相关基因严格受时空调控相继转录表达的结果。生精细胞的发生分多阶段进行,曲细精管截面上不仅可以看到处于精子发生过程不同阶段的各种生精细胞的组合,还可以看到支持细胞、间质细胞等其它类型的细胞。它们分别具有自己的基因时空表达规律,但是此过程中的分子机制尚未完全阐明。因此分离得到单一的生精细胞群并建立单一细胞类型的cDNA文库,就可以特异性地研究单一细胞的基因表达和有效地筛选不同生精细胞群之间差异表达的基因。本研究采用牛血清白蛋白的梯度沉降法分离高纯度生精细胞,并通过抑制性消减杂交(Suppressive Subtractive Hybridization,SSH)技术,构建了A型精原细胞和粗线期精母细胞的双向消减cDNA文库,并对筛选出来的部分已知和未知基因进行深入探索。根据SSH的结果,我们从A型精原细胞和粗线期精母细胞的双向消减cDNA消减文库中选择了576个PCR纯化产物进行斑点杂交(Dot Blotting)分析,以验证差异表达并分析其表达差异的强度。结果得到480个克隆在两种细胞之间表达差异相差大于2倍。随后我们选取40个存在明显表达差异的克隆进行测序分析,共产生了37个质量满意的ESTs序列,总测序成功率达到92.50%。将这些EST分为已知基因、已知EST和全新EST三类。由于不同组织中基因的表达水平不同及cDNA文库构建所产生的冗余性,结果从大鼠A型精原细胞和粗线期精母细胞双向消减cDNA文库中得到的已知基因、已知EST和全新EST分别为89.19%、5.40%和5.40%。对代表已知基因的ESTs按照功能分类,发现主要涉及细胞凋亡、信号传导和细胞间物质运输、细胞结构/运动、转录调节、代谢、线粒体基因几类,并初步探讨了大鼠精子发生过程中差异表达基因的作用和意义。将大鼠精原细胞特异表达的克隆编号为P5B10的EST序列进行RACE(RapidAmplification of cDNA Ends)技术扩增,获得一个新的cDNA序列,命名为大鼠泛素激活酶基因(Rattus norvegicus Ubiquitin-Activating Enzyme E1,Ubel)。在我们发现大鼠Ubel之前,GenBank库中没有大鼠Ubel的报道,我们第一次克隆了大鼠的Ubel基因的全长,登录GenBank,获得登录号为EF690356。该基因序列全长3433bp,其中开放阅读框有3171bp,编码一个含1057个氨基酸的蛋白质。预测其编码蛋白分子量为11.78kD,等电点5.32。Blast比对显示,Ubel基因与小鼠泛素激活酶基因(Ubelyl)的同源性为92%,与人泛素激活酶基因(UBE1)的同源性为83%。Ubel基因编码的蛋白质包含了泛素激活酶信号位点和泛素激活酶活化位点,分别位于410-418aa和629-637aa,它们均存在于人类和小鼠的泛素激活酶中。逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)结果显示,Ubel在大鼠睾丸中大量表达,而在心、肝、脾、肺、肾、肌肉、脑、卵巢中没有表达;我们用RT-PCR和荧光定量PCR检测了精原细胞、粗线期精母细胞、圆形精子细胞和支持细胞中Ubel的表达特性,结果显示精原细胞中Ubel基因大量表达,精母细胞、精子细胞和支持细胞中微弱表达。因此,Ubel是大鼠睾丸特异表达的基因,可能通过参与泛素/蛋白酶体途径来影响大鼠精子发生。以上这些工作为Ubel的进一步功能研究完成初步的准备工作。

全文目录

中文摘要  4-6
ABSTRACT  6-8
前言  8-11
本研究的技术路线  11-12
材料和方法  12-38
实验结果  38-54
讨论  54-65
小结  65-66
参考文献  66-72
附录1  72-73
文献综述  73-84
个人简历  84-85
致谢  85-86

大鼠睾丸特异表达基因Ube1的分离鉴定及生物学特征研究

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