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人PRL-3基因启动子的克隆及Snail调控元件的初步研究

作　者: 高维哲
导　师: 丁彦青；李建明
学　校: 南方医科大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: PRL-3 Snail 启动子调控元件
分类号: R346
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

蛋白酪氨酸磷酸酶-3(phosphatase of regenerating liver-3,PRL-3),属于PRL家族,是一种相对分子质量约20KD的蛋白磷酸酶,正常情况下在心脏和骨骼肌中表达。研究表明PRL-3与结直肠癌的侵袭转移有非常密切的关系。应用基因表达系列分析技术分析结直肠癌肝转移基因表达谱时发现,PRL-3是在18例结直肠癌肝转移标本中唯一持续高表达的基因。进一步发现,无论具体转移的部位如何,大多数结直肠癌的转移标本中PRL-3的转录水平均明显增加;而该基因在正常结直肠上皮或者非转移性原发结直肠癌中极少表达或不表达。PRL-3在肿瘤侵袭转移中的作用与其促进细胞增殖、迁移、侵袭、粘附有关,而且它能增强细胞生长、迁移以及肿瘤的浸润和转移能力。PRL-3属于蛋白质酪氨酸磷酸酶家族(protein tyrosine phosphatase,PTP)成员。PTP包括三个成员PRL-1、PRL-2及PRL-3,它们的序列均包含PTP活性位点标签序列HCXXGXXR,三个成员具有超过75%的氨基酸序列同源性,在功能上具有相似性。PRLs的催化域都缺少大多数磷酸酶发挥催化作用所需的丝氨酸-苏氨酸残基,只拥有单一的催化结构域。除了在C—末段含有—CAAX序列,可进行异戊烯化外,无其他任何辅助剪接、调节的结构域。PRLs以异戊烯化依赖方式存在于浆膜和内体(endosome)结构,这一生化特征提示它们在细胞信号转导中可能发挥重要作用。PRL-3又称为PTP4A3,位于人类第八号染色体上(8q24.3),从其基因组的结构看,其邻近区域存在如PTK2、GPR20及TSSK5P1等基因。PRL-3基因由5个外显子和4个内含子构成,其5’端和3’端均存在非翻译区域(UTR,untranslatedregions),UTR的存在可能与PRL-3基因的调控有关。PRL-3与肿瘤转移的关系已明确。到目前为止,仍存在许多待阐明的重要问题。PRL-3参与的信号通路至今尚不清楚;作为一种磷酸酶,其底物至今尚不确定;尤其重要的是调控PRL-3基因表达的机制尚不清楚。阐明PRL-3基因表达调控的机制是阐明PRL-3在肿瘤转移中作用的重要基础。锌指转录因子Snail属于转录抑制因子Snail超家族。Snail是一个重要的转录因子,在肿瘤上皮间叶转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程中起重要作用,研究发现,Snail可通过调节E-cad的表达参与EMT的发生。这一结论已经在多种肿瘤中如结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、恶性黑色素瘤及口腔鳞癌等获得证实。生物信息学分析表明,Snail的结合位点存在于PRL-3基因的启动子区域。作为肿瘤转移发生过程中重要的调节因子,Snail参与PRL-3基因表达及其转录调控的关系并不清楚。阐明Snail与PRL-3基因启动子之间的作用机制有重要作用。因此,鉴定PRL-3基因启动子区的所在位置及与PRL-3基因启动子结合的转录因子,可以为阐明其表达调控机制奠定基础,也为以其转录因子为靶分子进行肿瘤生物治疗提供依据。研究方法:1、人PRL-3基因启动子的克隆及其活性检测根据已知的生物信息学预测结果,将PRL-3基因启动子区域即PRL-3基因转录起始位点上游-754bp至下游455bp区域分为7段不同长度的DNA片段并分别克隆至具有萤光素酶报告基因的pGL3-Basic载体,然后经脂质体转染到人胚肾上皮细胞株293A及人大肠癌细胞株SW480、SW620,检测萤光素酶活性。2、人PRL-3基因启动子Snail调控元件的初步研究根据生物信息学预测结果,针对PRL-3基因转录起始位点上游-642bp～-383bp区域的Snail结合位点,设计特异性引物,引入突变碱基,构建Snail结合位点单处突变及两处、三处组合式突变载体,并分别克隆至具有萤光素酶报告基因的pGL3-Basic载体,然后经脂质体转染到人胚肾上皮细胞株293A及人大肠癌细胞株SW480、SW620,检测萤光素酶活性。3、人PRL-3基因转录起始位点上游-642bp～-383bp区域DNA截短片段的克隆及其活性检测将PRL-3基因转录起始位点上游-642bp～-383bp区域分为5段不同长度的DNA截短片段并分别克隆至具有萤光素酶报告基因的pGL3-Basic载体,然后经脂质体转染到人胚肾上皮细胞株293A及人大肠癌细胞株SW480、SW620,检测萤光素酶活性。结果:1、人PRL-3基因启动子不同截短片段的活性为确定PRL-3基因核心启动子区域,以人胚肾上皮细胞株293A及人大肠癌细胞株SW480、SW620为研究对象,将较完整的序列(PRL-3基因转录起始位点上游-754bp至下游455bp区域)分为7段不同长度的DNA片段克隆到萤光素酶报告基因载体中,并进行萤光素酶活性检测。结果显示获得的7段不同长度的PRL-3基因调控区DNA片段在三种不同的细胞株均具有较高的萤光素酶活性,其中PRL-3基因转录起始位点上游-642bp～-383bp的活性最强。2、人PRL-3基因启动子Snail调控元件的初步确定成功将PRL-3基因转录起始位点上游-624bp～-619bp的碱基GAGGTG突变为AGGGTG(该区域命名为A区域);将-522bp～-517bp的碱基CAGATG突变为TAGATG(该区域命名为B区域);将-500bp～-495bp的碱基CACCTG突变为TCCCTG(该区域命名为C区域)。PRL-3基因转录起始位点上游-624bp～-619bp的碱基突变导致-642bp～-383bp的DNA片段在293A、SW480及SW620细胞中的活性几乎完全丧失。PRL-3基因转录起始位点上游-62bp～-619bp的DNA片段是PRL-3基因表达调控的重要区域。3、人PRL-3基因转录起始位点上游-642bp～-383bp区域DNA截短片段的活性以人胚肾上皮细胞株293A及人大肠癌细胞株SW480、SW620为研究对象,选取前一步实验中活性最强的DNA序列区域(PRL-3基因转录起始位点上游-642bp～-383bp区域)进一步细分为5段长度不同的DNA截短片段克隆到相关启动子活性检测的萤光素酶报告基因载体中,并进行萤光素酶活性检测。结果证实不同长度调控区片段的萤光素酶活性在三种不同的细胞株中均存在差异,且PRL-3基因转录起始位点上游-642bp～-503bp的活性最强,-642bp～-573bp的活性基本丧失,表明PRL-3基因转录起始位点上游-642bp～-503bp区域为PRL-3基因启动子重要的调控区域。结论:1、PRL-3基因转录起始位点上游-642bp～-383bp区域具有强的启动子活性,是PRL-3基因核心启动子区域。2、PRL-3基因转录起始位点上游-624bp～-619bp区域存在相关转录因子Snail调控元件,Snail调控元件在PRL-3基因转录方面具有重要作用。3、PRL-3基因转录起始位点上游-642bp～-503bp区域启动子活性强于-642bp～-383bp区域启动子活性,-642bp～-503bp区域为PRL-3基因启动子重要的调控区域。

全文目录

摘要  3-7
ABSTRACT  7-13
前言  13-17
第一章人PRL-3基因启动子的克隆及其活性检测  17-48
  1. 材料与方法  17-29
  2. 结果  29-46
  3. 讨论  46-48
第二章人PRL-3基因启动子Snail 调控元件的初步研究  48-80
  1. 材料与方法  48-56
  2. 结果  56-77
  3. 讨论  77-80
第三章人PRL-3基因转录起始位点上游-642bp～-383bp区域DNA截短片段的克隆及其活性检测  80-97
  1. 材料与方法  80-87
  2. 结果  87-95
  3. 讨论  95-97
参考文献  97-102
全文小结  102-104
本研究的不足之处及后续工作  104-105
附录  105-106
研究生毕业论文统计学审稿证明  106-107
攻读硕士学位期间成果  107-108
致谢  108-109

人PRL-3基因启动子的克隆及Snail调控元件的初步研究

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