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蛋白纳米脂质体制备过程中的活性保护研究

作　者: 孙转
导　师: 葛志强
学　校: 天津大学
专　业: 制药工程
关键词: 蛋白质 脂质体 活性保护 蛋白质结构 分子模拟
分类号: TQ464.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


为研究蛋白和多肽类药物在制剂过程中的活性变化及其机理,减少药物在制剂过程中的活性损失,本文以胰蛋白酶为模型药物制备纳米脂质体,研究制备过程中胰蛋白酶的活性变化,并添加四种活性保护剂保护蛋白活性,通过检测蛋白的结构变化和分子动力学模拟过程来考察保护剂保护蛋白活性的机制。1,采用逆向蒸发法制备胰蛋白酶纳米脂质体,粒径160nm,包封率为47%,Zeta电位-58mv;胰蛋白酶在脂质体制备过程中活性损失为原始蛋白的37%,四种保护剂中PEG对活性的保护效果最好,可使活性保留为原始蛋白的46%,是一种良好的保护剂。2,采用圆二色谱和傅里叶红外光谱研究胰蛋白酶在制剂过程中的二级结构变化,应用荧光光谱研究蛋白的三级结构变化。圆二色谱显示胰蛋白酶在纳米脂质体制备过程中其二级结构中的α-螺旋含量由18.7%降为13.2%,β-折叠和β-转角含量分别由15.6%和27.0%增加到20.3%和31.9%,红外结果显示相同趋势。荧光数据表明有机溶剂处理后蛋白荧光性增加,制备成脂质体后荧光性减小,分子更加致密。四种保护剂的加入可以使蛋白的二级结构得到保留,其中PEG的保护效果最佳,但对三级结构的变化影响不大。3,采用flexX对接和amber软件对保护剂中最简单的分子精氨酸和胰蛋白酶活性中心进行了分子对接和分子模拟,研究精氨酸与胰蛋白酶的作用机制。结果显示精氨酸可进入到胰蛋白酶的活性腔道中,并与之可形成7对氢键,两者结合力很强,理论上可以维持蛋白活性腔的三维结构,保护活性腔不被外界因素的影响而发生变化。结果表明,保护剂可能是通过防止胰蛋白酶在脂质体制备过程中的二级结构变化,达到减少蛋白活性在制剂过程中的损失。

全文目录


摘要  3-4
ABSTRACT  4-7
前言  7-8
第一章 文献综述  8-17
  1.1 生物药物制剂研究进展  8
  1.2 蛋白和多肽类药物的活性研究方法  8-9
  1.3 蛋白和多肽类药物生产和存贮过程中的活性研究  9-12
    1.3.1 冷冻干燥对蛋白和多肽类药物活性的影响  9-10
    1.3.2 超声对蛋白和多肽类药物活性的影响  10
    1.3.3 油水界面对蛋白和多肽类药物活性的影响  10-11
    1.3.4 温度对蛋白和多肽类药物活性的影响  11
    1.3.5 超滤/高速匀浆过程对蛋白和多肽类药物活性的影响  11-12
    1.3.6 其他工艺过程对蛋白和多肽类药物活性的影响  12
  1.4 蛋白和多肽类药物在制剂和存储过程中的活性保护方法  12-16
    1.4.1 工艺改进法保护蛋白和多肽类药物活性  13
    1.4.2 基因改造法保护蛋白和多肽类药物活性  13
    1.4.3 化学修饰法保护蛋白和多肽类药物活性  13-14
    1.4.4 保护剂保护蛋白和多肽类药物活性  14-15
    1.4.5 其他保护蛋白和多肽类药物活性的方法  15-16
  1.5 本文研究内容与意义  16-17
第二章 胰蛋白酶纳米脂质体制备过程中的活性变化  17-28
  2.1 试验材料和方法  17-23
  2.2 结果与讨论  23-28
    2.2.1 纳米脂质体粒径  23-24
    2.2.2 脂质体包封率和载药量  24
    2.2.3 脂质体Zeta 电位  24-25
    2.2.4 脂质体制备过程中胰蛋白酶活性变化  25-26
    2.2.5 保护剂对脂质体制备过程中胰蛋白酶活性的保护效果  26-28
第三章 脂质体制备过程对胰蛋白酶结构的影响  28-38
  3.1 实验条件和方法  28-29
    3.1.1 实验条件  28
    3.1.2 实验方法  28-29
  3.2 结果与讨论  29-38
    3.2.1 不同操作和保护剂对胰蛋白酶圆二色谱的影响  29-33
    3.2.2 不同操作和保护剂对胰蛋白酶荧光光谱的影响  33-35
    3.2.3 不同操作和保护剂对胰蛋白酶傅里叶红外光谱的影响  35-38
第四章 保护剂精氨酸与胰蛋白酶结合的分子动力学模拟  38-44
  4.1 实验条件和方法  38-40
    4.1.1 实验条件  38-39
    4.1.2 实验方法  39-40
  4.2 结果与讨论  40-44
    4.2.1 胰蛋白酶和精氨酸复合物的柔性分析  40-41
    4.2.2 胰蛋白酶活性中心的结构分析  41
    4.2.3 胰蛋白酶和精氨酸复合物的构象分析  41-44
第五章 结论与展望  44-45
  5.1 结论  44
  5.2 展望  44-45
参考文献  45-49
致谢  49

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 制药化学工业 > 生物制品药物的生产 > 氨基酸、肽、蛋白质
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