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兔肝辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素K3的还原作用
作 者: 肖李锋
导 师: 黄东阳
学 校: 汕头大学
专 业: 生物化学与分子生物学
关键词: 辅酶Ⅱ依赖性视黄醛还原酶(NRDR) 维生素K3 维生素K4 高效液相色谱
分类号: Q55
类 型: 硕士论文
年 份: 2008年
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内容摘要
维甲酸(RA)是脊椎动物体内重要的生理活性物质,在细胞生长、细胞分化、形态发生、免疫功能调节等方面具有广泛的生物学作用。维甲酸在体内经由视黄醇(retinol)氧化成视黄醛(retinal)再氧化成维甲酸两步酶促反应生成,由视黄醇生成视黄醛的反应为限速步骤。辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶(NADP(H)-Dependent Retinol Dehydrogenase /Reductase NRDR)是黄东阳教授等从兔肝中发现并纯化的一种酶,具有很高的催化视黄醛(retinal)和视黄醇(retinol)之间氧化还原反应的活性,对体内类视黄醇和维甲酸(RA)的代谢平衡起着重要的调节作用。NRDR不仅对视黄醛具有较强的还原活性,还对其它很多醛酮类物质存在还原活性,所以我们认为NRDR在体内可能还担负着其他一些重要的生理功能。维生素K3(menadione)在奈醌环的1,4号位上带有两个酮基团,有着成为NRDR底物的可能。鉴于维生素K3是维生素K1(Phylloquinone)和维生素K2(Menaquinones)前体,在凝血等方面发挥着重要的作用,因此,有必要对NRDR潜在的生理功能及其对维生素K3可能的还原活性进行进一步的研究。本研究首先构建含兔NRDR全长序列的表达载体,并转化到BL21-AI菌株中进行诱导表达4 h。经超声裂解,离心后得到细菌裂解上清液,再通过金属离子亲和层析得到纯化蛋白,经过酶活性分析及SDS-PAGE分析证实得到该纯化酶蛋白为氨基端含6×His标签的兔NRDR重组蛋白。利用该纯化的重组兔NRDR酶蛋白对多种可能的底物进行活性分析,包括9,10-菲醌、维生素BB6、前列腺素E2,结果发现兔NRDR存在维生素K3(menadione)还原活性。通过化学合成、高效液相色谱分析、荧光光谱扫描等方法对维生素K3的还原产物进行鉴定,证实兔NRDR能还原维生素K3生成维生素K4(menadiol),并在含有十二烷基磺酸钠(SDS)及去除氧气条件下,利用高效液相色谱(HPLC)对其进行酶动力学分析,测得其Km值和Vmax分别为30.70μmol和9.091μmol/(min·mg)。本研究提示参与维生素K类的代谢可能是NRDR的另一重要生理功能。
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全文目录
中文摘要 4-6 英文摘要 6-8 缩略语 8-12 引言 12-16 材料与方法 16-33 1. 材料 16-19 1.1 主要试剂 16-18 1.1.1 cDNA 克隆及载体构建试剂 16-17 1.1.2 蛋白分析试剂 17 1.1.3 酶活性分析试剂 17 1.1.4 高效液相色谱及荧光光谱扫描试剂 17-18 1.2 主要仪器 18-19 2. 方法 19-33 2.1 Rabbit-NRDR 重组蛋白表达载体的构建 19-24 2.1.1 Gateway Technology 基因克隆和蛋白表达系统介绍 19 2.1.2 重组质粒的构建 19-21 2.1.3 重组质粒的初步筛选 21-22 2.1.4 测序确认 22 2.1.5 提取重组质粒 22-23 2.1.6 LR 反应 23-24 2.2 兔NRDR在BL21-AITM细胞中的表达及性质鉴定 24-29 2.2.1 试剂的配制 24-26 2.2.2 诱导表达 26 2.2.3 蛋白浓度测定 26-27 2.2.4 SDS 蛋白电泳 27 2.2.5 在340nm 下监测NADPH 的消耗 27-28 2.2.6 重组 Rabbit-NRDR 的纯化 28-29 2.2.7 纯化重组蛋白的保存 29 2.3 利用反相HPLC 对Rabbit-NRDR 进行酶动力学研究 29-32 2.3.1 反相高压液相色谱法检测条件 29 2.3.2 流动相的配制 29-30 2.3.3 维生素K3的浓度梯度的建立 30 2.3.4 增溶剂 SDS 的使用 30 2.3.5 密闭反应体系的建立 30-31 2.3.6 表达纯化蛋白活性 Km 值的测定 31-32 2.4 产物的鉴定 32-33 结果 33-40 1 Rabbit-NRDR 重组蛋白表达载体的确认 33 1.1 菌落 PCR 确认入门克隆 33 1.2 测序确认 NRDR 全长序列 33 1.3 菌落PCR 确认表达克隆 33 2 Rabbit-NRDR 在BL21-AITM 细胞中的表达 33-34 3 Rabbit-NRDR 表达蛋白的纯化、蛋白浓度测定及活性测定 34-38 3.1 Rabbit-NRDR 表达蛋白的纯化 34 3.2 利用HPLC 分析Rabbit-NRDR 对维生素K3 的还原活性 34-37 3.3 Km 值测定 37-38 4 Rabbit-NRDR 对维生素K3 还原产物的鉴定 38-40 讨论 40-44 结论 44-45 参考文献 45-50 致谢 50-51 个人简历 51
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中图分类: > 生物科学 > 生物化学 > 酶
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