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极细链格孢菌功能基因HIS3及LEU2的初步研究

作　者: 万英
导　师: 黄云；蒋伶活
学　校: 四川农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 极细链格孢菌 cDNA表达文库 AtLEU2基因 AtHIS3基因 原生质体转化
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


极细链格孢菌（Alternaria tenuissima）是一种植物病原真菌,对农业生产危害巨大,然而其在生防、环保等方面也有应用,因此从分子水平研究该菌的功能基因的调控机制,对进一步开发利用该菌具有重要意义。在真核微生物的遗传学研究中LEU2和HIS3基因是重要的营养标记,通过遗传学手段,我们筛选获得了极细链格孢菌AtLEU2及AtHIS3基因,并且研究了AtLEU2及AtHIS3基因互补酿酒酵母的功能。以G418抗性基因作为选择标记,构建了用于敲除极细链格孢菌AtLEU2及AtHIS3基因的质粒,建立了极细链格孢菌的遗传转化系统,为进一步研究AtLEU2及AtHIS3基因的功能奠定了坚实的基础,主要研究结果如下:1、将极细链格孢菌cDNA表达文库转化到酵母LEU2缺失突变株,用SD-LEU培养基进行筛选,获得了3个正常生长的酵母转化子。对转化子质粒进行测序分析,发现这些基因编码的蛋白质序列均与酵母LEU2（ScLEU2）基因编码的363个氨基酸同源（命名为AtLEU2,其编码的蛋白质命名为Atleu2p）,该基因编码的蛋白与植物病原菌小麦颖枯病CAB72262;灰葡萄孢霉EDN21270;玉蜀黍赤XP386851,以及水稻稻瘟病病菌XP367617所编码的β-苹果酸脱氢酶同源,相似性分别达到94%、74%、1%和69%,与酿酒酵母、粗糙链孢霉EAA33847相似性为70%和63%。2、将极细链格孢菌cDNA表达文库转化到酵母HIS3缺失突变株,在SD-HIS培养基上筛选,获得了2个正常生长的转化子。所得基因的开放阅读框（ORF）含有717个碱基,编码238个氨基酸,与酵母HIS3（ScHIS3）基因同源（命名为AtHIS3,其编码的蛋白质命名为AtHis3p）,AtHis3p与植物病原真菌链格孢BAF69039,小麦颖枯病EAT83561,灰葡萄孢霉EDN23196,玉蜀黍赤霉XP386269,以及水稻稻瘟病病菌XP367617中编码的咪唑甘油磷酸脱水酶同源,相似性分别达到100%,90%,68%,65%和63%;与生防菌哈茨木霉P34041相似性达64%;与酿酒酵母,粗糙链孢霉XP961386编码的蛋白相似性达64%和66%。3、分别选择以AtLEU2及AtHIS3基因上下游同源序列500 bp左右作为同源臂,在上游同源序列3’端连接G418抗性基因（以保证缺失突变株的检测及鉴定）,构建了用于敲除极细链格孢菌AtLEU2及AtHIS3基因的质粒,为在极细链格孢菌中敲除AtLEU2及AtHIS3基因奠定了坚实的基础,为进一步研究链格孢菌AtLEU2及AtHIS3基因的功能及作用机理提供了重要的试验材料。4、基于极细链格孢菌在含有G418（100μg/mL）的PDA培养基上不能生长的药物敏感性实验结果,建立了用G418抗性基因作为选择标记的遗传转化系统,从而为研究极细链格孢菌功能基因的敲除、缺失突变株鉴定提供了可靠的筛选标记,并为后续研究打下必要的基础。

全文目录


摘要  3-5
Abstract  5-10
第一章 文献综述  10-19
  1 研究进展  10-15
    1.1 链格孢菌研究概况  10-15
      1.1.1 链格孢菌的危害  10-12
      1.1.2 次生代谢物—毒素  12-13
      1.1.3 应用前景  13-15
        1.1.3.1 生物防治  13-14
        1.1.3.2 降解作用  14
        1.1.3.3 生物源除草剂  14-15
        1.1.3.4 蛋白激发子  15
  2 极细链格孢菌功能基因的研究  15-16
  3 丝状真菌的转化  16-19
    3.1 研究概况  16-17
      3.1.1 转化方法  16-17
        3.1.1.1 CaCl_2/PEG介导的原生质体的转化  16
        3.1.1.2 基因枪的转化  16-17
        3.1.1.3 限制酶介导的转化  17
        3.1.1.4 根癌农杆菌介导的转化(ATMT)  17
        3.1.1.5 电转化法  17
    3.2 转化中的选择标记  17-19
第二章 编码LEU2和HIS3基因的极细链格孢菌cDNA文库分离和鉴定  19-32
  1 实验材料  19-20
    1.1 菌株及质粒  19
    1.2 培养基  19-20
  2 试验方法  20-23
    2.1 极细链格孢菌cDNA表达文库质粒转化酵母缺失菌株  20
    2.2 AtHIS3基因及AtLEU2基因的cDNA分离  20-22
      2.2.1 极细链格孢菌cDNA表达文库初步筛选  20-21
      2.2.2 酵母质粒的提取  21
      2.2.3 细菌转化  21
      2.2.4 细菌质粒提取  21-22
    2.3 酵母质粒(DH5α)复验检测  22-23
      2.3.1 酵母质粒(DH5α)BsrGI酶切检测  22
      2.3.2 酵母质粒(DH5α)转化酵母缺失突变菌株  22-23
  3 实验结果  23-30
    3.1 转化效率及转化子数量  23-24
    3.2 BsrGI酶切酵母质粒(DH5α)  24
    3.3 酵母质粒(DH5α)互补酵母缺失株  24-25
    3.4 酵母质粒(DH5α)测序结果分析  25-30
  4 结论与讨论  30-32
第三章 极细链格孢菌LEU2及HIS3基因敲除质粒构建及原生质体转化体系的建立  32-46
  1 实验材料  32
    1.2 主要试剂、酶及载体  32
    1.3 培养基和试剂  32
  2 实验方法  32-38
    2.1 链格孢菌药物敏感性试验  33
      2.1.1 菌株活化  33
      2.1.2 药物敏感性试验  33
    2.2 LEU2和HIS3基因敲除质粒构建  33-37
      2.2.1 LEU2及HIS3基因同源片断的亚克隆  33-36
        2.2.1.1 引物的设计  33-34
        2.2.1.2 PCR扩增目的片段  34-35
        2.2.1.3 PCR产物的连接与转化  35
        2.2.1.4 阳性克隆的确定  35-36
          2.2.1.4.1 菌液PCR的鉴定  35-36
          2.2.1.4.2 酶切法确定T载体插入片段  36
      2.2.3 pGL-b和pGH-a质粒的构建  36
      2.2.4 pGH-a-b和pGL-b-a质粒的构建  36-37
    2.3 原生质体转化体系的建立  37-38
      2.3.1 原生质体的制备  37
      2.3.2 原生质体的转化  37
      2.3.3 G418抗性筛选及稳定性测试  37
      2.3.4 转化子的验证  37-38
  3 实验结果  38-43
    3.1 药物敏感性测定  38
    3.2 LEU2基因敲除质粒的构建  38-39
      3.2.1 PCR产物的连接与转化  38
      3.2.2 pGL-b的构建  38-39
      3.2.3 pGL-b-a质粒的构建  39
    3.3 HIS3基因敲除质粒的构建  39-41
      3.3.1 PCR产物的连接和纯化  39-40
      3.3.2 pGH-a的构建  40
      3.3.3 pGH-a-b质粒的构建  40-41
    3.4 原生质体转化体系的建立  41-43
      3.4.1 原生质体的制备  41-42
      3.4.2 转化与转化子的鉴定  42
      3.4.3 转化子的检测  42-43
  4 结论与讨论  43-46
    4.1 筛选标记  43-44
    4.2 敲除质粒的构建  44-45
    4.3 原生质体转化体系的建立  45-46
参考文献  46-53
致谢  53-54
在读期间发表的学术论文  54

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学
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