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中国美利奴绵羊MHC ClassⅡb区段349Ⅰ12 BAC克隆基因组成与结构分析

作　者: 白大章
导　师: 高剑峰
学　校: 石河子大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 细菌人工染色体(BAC) cDNA表达文库 放射性探针 噬菌体原位杂交 生物信息学分析
分类号: S826
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


旦的：用插有中国美利奴绵羊(新疆军垦型)MHC ClassⅡb区genomic DNA的349I12 BAC克隆制备32P标记的放射性探针,进行噬菌体原位杂交筛选由中国美利奴绵羊(新疆军垦型)外周免疫器官组织构建的cDNA文库。旨在获得349I12 BAC克隆内MHC片段的基因组成与结构信息,为后续中国美利奴绵羊MHC区段基因图谱绘制、绵羊MHC区段内重要经济性状相关基因研究和绵羊疾病抗性及易感性相关基因研究奠定基础。方法：首先,利用GENSCAN软件对349I12 BAC克隆内插入MHC片段进行基因预测。其次,利用GeneQuest程序对349I12 BAC克隆内插入片段进行电子模拟酶切电泳,筛选合适的限制性内切酶,用于实验中酶切349I12 BAC克隆质粒,制备32P标记的放射性探针。然后,将筛选出来的阳性单克隆送北京华大基因测序。最后,利用SeqMan和MegAlign程序对测序结果进行序列拼接和去重复,VecScreen软件去载体,SIM4软件将其定位到349I12 BAC克隆内的MHC片段上。结果：1、GENSCAN软件预测结果显示349I12 BAC克隆插入片段中含有10个基因,其中断裂基因9个；不完整基因1个;单外显子基因2个。该结果可为后续实验提供一个基因数目和结构上的参考。2、用限制性内切酶BsaJⅠ酶切349I12 BAC克隆内插入的中国美利奴绵羊MHC ClassⅡb区genomic DNA,然后用klenow酶对酶切片段进行末端32P标记制备放射性探针。经过多次噬菌体原位杂交筛选中国美利奴绵羊cDNA文库后,获得19个阳性单克隆。将筛选到的所有阳性单克隆送北京华大基因测序,测序结果经整理后,最终得到17条不同的cDNA序列。3、利用SIM4软件进行cDNA和genomic DNA (？)司的序列剪接比对分析,结果显示17条cDNA序列中有10条cDNA序列可以精确定位到349I12 BAC克隆内的中国美利奴绵羊MHC ClassⅡb区genomic DNA上。结论：本实验通过噬菌体原位杂交筛选中国美利奴绵羊cDNA文库,最终获得17条不同的cDNA序列。这17条cDNA序列中有10条序列都能够很好地定位到349I12 BAC克隆内中国美利奴绵羊MHC ClassⅡb区genomic DNA上,说明噬菌体原位杂交筛选cDNA文库,是一种行之有效的、高效的表达序列分离方法。本实验可为后续中国美利奴绵羊MHC区段基因图谱的绘制奠定基础；可为后期深入研究绵羊MHC基因与疾病抗性、易感性的关系,为绵羊疾病的预防、诊断和绵羊遗传抗病育种奠定基础。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-7
目录  7-8
英文缩写词表  8-9
1 背景  9-22
  1.1 绵羊(Ovis aries)简介及其基因组研究进展  9-11
  1.2 主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)的概述  11-15
  1.3 MHC的组成  15-17
  1.4 MHC与疾病的关系  17-18
  1.5 本研究的目的和意义  18-21
  1.6 技术路线  21-22
2、材料和方法  22-34
  2.1 材料  22-27
  2.2 方法  27-34
3、结果  34-43
  3.1 绵羊MHC class Ⅱ b区段349I12 BAC克隆的基因预测  34
  3.2 利用DNAStar软件分析349I12 BAC克隆酶切位点并筛选限制性内切酶  34-35
  3.3 绵羊MHC class Ⅱb区段349I12 BAC克隆质粒的提取  35-36
  3.4 绵羊MHC class Ⅱb区段349I12 BAC克隆质粒的酶切  36
  3.5 以349I12 BAC克隆酶切片段制备探针筛选cDNA文库  36-37
  3.6 阳性单克隆测序与生物信息学分析  37-43
4、讨论  43-49
  4.1 分离表达序列的方法  43-44
  4.2 噬菌体原位杂交分离表达序列  44-45
  4.3 核酸探针制备  45-46
  4.4 生物信息学分析  46-49
5 结论  49-50
参考文献  50-53
附录  53-65
致谢  65-66
作者简介  66-67
导师评阅表  67

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 羊
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