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链霉菌AM-7161遗传操作系统的建立和糖基转移酶基因med-ORF8原核表达的研究

作　者: 邓会群
导　师: 李爱英
学　校: 华中师范大学
专　业: 微生物学
关键词: 链霉菌 美达霉素 遗传操作系统 原生质体转化 C-糖基化 C-糖基转移酶表达
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


链霉菌（Streptomyces sp AM-7161,缩写AM-7161）可以产生具有抗癌抗菌活性的芳香聚酮抗生素美达霉素（medermycin）。美达霉素生物合成中许多后期修饰步骤（比如有关脱氧六糖碳基的合成、C-糖基转移以及立体异构的形成）都是令人感兴趣的问题。但针对这个菌株的遗传操作一直非常困难,限制了对这些问题的研究,因此本研究首先对这个菌株的遗传操作系统进行了优化,然后对美达霉素生物合成中的C-糖基转移酶基因med-ORF8的原核表达系统进行了摸索。（1）菌株AM-7161遗传操作系统的建立和优化:首先对菌株AM-7161的培养条件、原生质体制备、原生质体转化和再生的条件进行了优化;在此基础上,从大肠杆菌DH5α细胞中提取的两种质粒（整合型质粒pSET152和自主复制型质粒pWHM4*）通过原生质体转化可以高效率导入这个菌株（转化效率可达102-103转化子/微克DNA）。同时,优化了菌株AM-7161与大肠杆菌之间的接合转移系统,外源DNA也可通过接合转移系统进入AM-7161。结果表明,在这个菌株中进行遗传操作的条件已经建立,可以对一些美达霉素生物合成酶基因（如med—ORF8）展开体内功能遗传学分析（如突变分析或互补分析）,同时也说明此菌株对甲基化的外源DNA不存在限制性,其染色体上含有pSET152的整合位点;（2）med-ORF8原核表达体系的建立:med-ORF8位于美达霉素生物合成基因簇中,是美达霉素合成必需的基因,推测参与了美达霉素的C-C糖苷键的形成。本研究中,首先把med-ORF8基因克隆到大肠杆菌基因表达载体pET23a（+）上,构建表达质粒pHSL51,然后把表达质粒pHSL51导入大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达,对诱导条件了优化,并通过Western Blotting检测到目的蛋白,酶的提取和纯化条件正在进一步摸索中。以上这些研究工作将有助于推进美达霉素生物合成基因的功能研究。

全文目录


中文摘要  4-5
Abstract  5-9
第一章 前言  9-20
  1.1 链霉菌AM-7161  9-12
    1.1.1 链霉菌和抗生素  9-10
    1.1.2 芳香聚酮抗生素和聚酮合成酶  10-11
    1.1.3 美达霉素及Streptomyces sp.AM-7161  11-12
  1.2 链霉菌遗传操作系统  12-14
    1.2.1 链霉菌遗传操作系统的建立  12-14
    1.2.2 美达霉素产生菌遗传操作系统的建立和优化  14
  1.3 C-糖基化和C-糖基转移酶  14-17
    1.3.1 糖基化  14
    1.3.2 C-糖基化  14-16
    1.3.3 C-糖基转移酶  16-17
  1.4 链霉菌基因的原核表达  17-19
    1.4.1 大肠杆菌原核表达系统  17
    1.4.2 大肠杆菌表达的载体  17-19
  1.5 本项目研究的内容和意义:  19-20
    1.5.1 体外研究C-糖基转移酶Med-ORF8的内容和意义  19
    1.5.2 Streptomyces sp AM-7161遗传操作系统优化的内容和意义  19-20
第二章 材料和方法  20-28
  2.1 菌株  20
  2.2 质粒  20-21
  2.3 试剂  21-26
    2.3.1 大肠杆菌质粒提取试剂  21
    2.3.2 Western Blotting试剂  21-24
    2.3.3 蛋白纯化试剂  24-25
    2.3.4 链霉菌质粒提取试剂  25
    2.3.5 缓冲液  25
    2.3.6 抗生素和试剂  25-26
    2.3.7 酶和生化试剂  26
  2.4 培养基  26-28
    2.4.1 大肠杆菌液体培养基  26
    2.4.2 大肠杆菌固体培养基  26
    2.4.3 链霉菌固体产孢培养基  26-27
    2.4.4 链霉菌液体培养基  27
    2.4.5 链霉菌再生培养基  27-28
2.5 实验方法  28-37
  2.5.1 大肠杆菌质粒提取  28-29
  2.5.2 大肠杆菌转化  29
  2.5.3 链霉菌培养  29-31
  2.5.4 接合转移  31-32
  2.5.5 DNA体外操作  32-33
  2.5.6 琼脂糖凝胶电泳  33
  2.5.7 Western Blotting  33-35
  2.5.8 蛋白纯化  35
  2.5.9 DNA纯化  35-37
第三章 链霉菌AM-7161遗传操作系统的建立  37-51
  3.1 Streptomyces sp AM-7161不同培养条件的优化  37-39
    3.1.1 AM-7161对抗生素敏感性的测定  37-38
    3.1.2 产孢培养基的优化  38-39
    3.1.3 菌丝体生长培养基的优化  39
  3.2 链霉菌Streptomyces sp AM-7161原生质体的制备和再生条件的优化  39-42
  3.3 链霉菌AM-7161的原生质体转化  42-47
    3.3.1 整合型外源质粒DNA转化链霉菌AM-7161原生质体  42-45
    3.3.2 自主复制型质粒pWHM4~*转化链霉菌AM-7161原生质体  45-47
  3.4 接合转移  47-49
    3.4.1 pSET152通过接合转移进入AM-7161  48-49
    3.4.2 接合转移子的分子水平验证  49
  3.5 讨论  49-51
第四章 链霉菌AM-7161中的C-糖基转移酶基因med-ORF8表达质粒的构建和表达系统的建立  51-64
  4.1 med-ORF8基因扩增  52
  4.2 扩增产物的序列验证  52-55
  4.3 med-ORF8的表达质粒的构建  55-57
  4.4 原核表达重组菌的构建  57-58
  4.5 Med-ORF8的诱导表达  58-62
    4.5.1 初步诱导表达  58
    4.5.2 目的蛋白存在部位的检测  58-59
    4.5.3 优化诱导条件  59-60
    4.5.6 Western blotting验证目的蛋白带  60-62
  4.6 讨论  62-64
总结和展望  64-65
参考文献  65-70
硕士期间发表论文  70-71
致谢  71

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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