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极细链格孢菌HOG1、PBS2基因克隆及功能初步分析

作　者: 冯飞
导　师: 邱德文
学　校: 中国农业科学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 极细链格孢菌 cDNA表达文库 AtHOG1及AtPBS2基因 蛋白激酶 蛋白激酶激酶
分类号: S432.44
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


链格孢菌既是一类重要植物病原真菌，又是具有应用前景的生物资源。从分子水平研究该类菌的功能基因的调控机制，对进一步开发利用该菌具有重要意义。HOG途径参与诱导胁迫反应基因的表达、细胞形态恢复、信息素反应途径的阻遏及致病性等过程。Hog1p和Pbs2p蛋白激酶在细胞壁结构完整性、孢子分化、菌丝形成和浸入生长以及高渗透压甘油形成过程中起到重要作用。本研究通过运用基于λ噬菌体特异位点重组反应Gateway?系统构建极细链格孢菌（Alternaria tenuissima）cDNA表达文库。通过遗传学手段，我们筛选获得了极细链格孢菌（A．tenuissima）AtHOG1及AtPBS2基因，并且研究了AtHOG1及AtPBS2基因的功能。建立了以抗性基因作为选择标记的技术体系，利用DNA同源重组技术，成功构建了用于敲除极细链格孢菌（A．tenuissima）AtHOG1及AtPBS2基因的质粒，为进一步研究AtHOG1及AtPBS2基因的功能奠定了坚实的基础，主要研究结果如下：1、链格孢属（Alternaria Nees）真菌是一类庞大的，难以进行形态鉴定的常见真菌。为了进一步确定本试验所用菌种的分类地位，本文成功克隆了rDNA基因。通过序列比对，构建了7个相似菌株的系统发育树，发现该菌株与极细链格孢菌（A．tenuissima）相应的rDNA高度同源，因此将链格孢菌JH505菌株定名为极细链格孢菌（A．tenuissima）。2、构建了含有attL1及attL2重组位点的重组表达质粒（pRS-DEST42），使用Gateway? LR重组技术与入门文库发生特异重组交换而构建表达文库。经检测，表达文库的平均滴度为2.44x106（cfu／ml），文库总容量为2.44x107。阳性克性率为100％，平均插入片段大约为1381 bp左右。通过对阳性克隆测序结果的分析，cDNA序列完整。3、从7.62x105个极细链格孢菌（A．tenuissima）cDNA表达文库酵母转化子中筛选获得了12个能使酵母hog1基因缺失突变株在YEPD+1MNaCl中生长且含有极细链格孢菌（A．tenuissima）cDNA表达文库质粒的转化子。这些基因编码的蛋白质序列均与酵母HOG1（ScHOG1）基因编码的355个氨基酸同源，命名为AtHOG1，其编码的蛋白质命名为AtHog1p，该基因编码的蛋白与稻瘟菌MG01822.4蛋白、黑粉菌UM02357.1蛋白、禾谷镰刀菌FG09612.1蛋白及酿酒酵母ScHog1p蛋白的相似性分别为96％、92％、90％和88％。序列比对结果显示，酵母ScHog1p蛋白的催化结构域与其同源蛋白具高度保守，而且三个催化位点及赖氨酸残基均位于ATP结合域内，说明Hog1p蛋白在丝状真菌中是高度保守的。4、从1.56×105个转化子中最终分离而获得了1个能使酵母pbs2缺失突变株在高盐环境下生长的表达文库质粒。该基因全长2，492 bp，编码683个氨基酸。与酵母ScPbs2p蛋白具有42.6％的同源性，命名为AtPBS2，其编码的氨基酸为AtPbs2p。AtPbs2p与烟曲霉XP752961、稻瘟菌XP366048及禾谷镰刀菌XP388867同源序列分别具有55.3％、50.2％和48.6％的相似性。ScPbs2p的催化结构域在丝状真菌也是高度保守的。5、通过对极细链格孢菌（A．tenuissima）cDNA表达文库的筛选，获得能使酿酒酵母HOG1及PBS2基因缺失突变株具有对抗盐胁迫反应的质粒，通过对AtHOG1及AtPBS2基因在酵母突变菌株中的再次功能验证，发现AtHOG1及AtPBS2基因分别发挥了HOG通路途径的HOG1及PBS2基因的功能，即在盐胁迫条件下体现出与ScHog1p及ScPbs2p蛋白相同的功能，使酵母缺失突变株在高盐环境中生长。6、基于极细链格孢菌（A．tenuissima）在含有G418（100μg／ml）和潮霉素（Hygromycin B）（100μg／ml）的PDA培养基上不能生长的药物敏感性实验结果，建立了用G418抗性基因及潮霉素（Hygromycin B）抗性基因作为选择标记的技术体系，从而为研究极细链格孢菌（A．tenuissima）功能基因的敲除、缺失突变株鉴定提供了可靠的筛选标记，并为后续研究打下必要的基础。7、利用同源重组技术，分别选择以AtHOG1及AtPBS2基因上下游同源序列约500 bp作为同源臂，上游同源序列3’端连接G418抗性基因，以保证缺失突变株的检测及鉴定。成功构建了用于敲除极细链格孢菌（A．tenuissima）AtHOG1及AtPBS2基因的质粒，为在极细链格孢菌（A．tenuissima）中敲除AtHOG1及AtPBS2基因奠定了坚实的基础，为进一步研究链格孢菌（A．tenuissima）AtHOG1及AtPBS2基因的功能及作用机理提供了重要的试验材料和工具。

全文目录


摘要  6-8
Abstract  8-14
第一章 前言  14-33
  1.1 链格孢菌研究概况  14-19
    1.1.1 链格孢菌分类地位  14-15
    1.1.2 链格孢菌现代分类学研究  15-16
    1.1.3 植物致病性及危害  16-17
    1.1.4 次生代谢物—毒素  17-19
  1.2 生物资源利用研究  19-21
    1.2.1 生物防治有益菌  19
    1.2.2 降解作用  19
    1.2.3 生物源除草剂  19-20
    1.2.4 新品种选育  20
    1.2.5 蛋白激发子  20-21
  1.3 丝状真菌蛋白激酶的研究现状  21-32
    1.3.1 蛋白激酶在细胞信号转导中的作用和意义  21-22
    1.3.2 丝状真菌蛋白激酶的种类及功能  22-32
  1.4 研究目的和意义  32-33
第二章 链格孢菌(Alternaria spp.) JH505菌株鉴定  33-50
  2.1 试验材料  33
    2.1.1 实验菌株  33
    2.1.2 主要试剂、酶及载体  33
    2.1.3 主要实验仪器及耗材  33
  2.2 试验方法  33-39
    2.2.1 实验菌株的活化与培养  33-34
    2.2.2 链格孢菌(Alternaria spp.) JH505菌株大量产孢  34
    2.2.3 链格孢菌基因组DNA提取—CTAB法  34-39
  2.3 结果与讨论  39-50
    2.3.1 结果  39-47
    2.3.2 讨论  47-50
第三章 极细链格孢菌cDNA表达文库的构建  50-64
  3.1 试验材料  50
    3.1.1 主要试剂、酶及载体  50
    3.1.2 主要实验仪器及耗材  50
  3.2 试验方法  50-58
    3.2.1 attR1-ccdB-attR2片断的亚克隆  52-54
    3.2.2 cDNA表达文库的构建  54-58
  3.3 结果与讨论  58-64
    3.3.1 结果  58-61
    3.3.2 讨论  61-64
第四章 极细链格孢菌HOG1、PBS2基因克隆及功能验证  64-85
  4.1 试验材料  64
    4.1.1 主要试剂、酶及载体  64
    4.1.2 主要实验仪器及耗材  64
  4.2 试验方法  64-70
    4.2.1 主要培养基的制备  64-65
    4.2.2 极细链格孢菌cDNA表达文库质粒中量提取  65
    4.2.3 极细链格孢菌cDNA表达文库质粒转化酵母菌  65-66
    4.2.4 AtHOG1基因及AtPBS2基因的克隆  66-70
  4.3 结果与讨论  70-85
    4.3.1 结果  70-82
    4.3.2 讨论  82-85
第五章 极细链格孢菌HOG1及PBS2基因敲除质粒构建及鉴定  85-95
  5.1 试验材料  85
    5.1.1 实验菌株  85
    5.1.2 主要试剂、酶及载体  85
    5.1.3 主要实验仪器及耗材  85
  5.2 试验方法  85-89
    5.2.1 链格孢菌药物敏感性试验  85-86
    5.2.2 HOG1及PBS2基因敲除质粒构建  86-89
  5.3 结果与讨论  89-95
    5.3.1 结果  89-92
    5.3.2 讨论  92-95
第六章 全文结论  95-99
  6.1 菌株的鉴定  95
  6.2 表达文库构建  95-96
    6.2.1 表达文库质粒载体  95
    6.2.2 表达文库的构建及质量评价  95-96
  6.3 AtHOG1及AtPBS2基因克隆及功能分析  96-97
  6.4 HOG1及PBS2基因敲除质粒构建  97-99
    6.4.1 筛选标记  97
    6.4.2 敲除质粒的构建  97-99
参考文献  99-114
致谢  114-115
作者简历  115

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 植物病害及其防治 > 侵（传）染性病害 > 真菌
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