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慢病毒介导的RNAi抑制小鼠血管内皮细胞α1，3GT表达的研究

作　者: 谷雅川
导　师: 章志翔；戚峰
学　校: 天津医科大学
专　业: 外科学
关键词: 慢病毒 RNA干扰异种移植超急性排斥反应 α1,3GT Galα(1,3)Gal
分类号: R346
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

目的:应用RNAi(RNA interference)技术探讨靶向α1,3半乳糖基转移酶(α1,3GT)的shRNA重组慢病毒载体抑制小鼠血管内皮细胞α1,3GT和α1,3半乳糖残基Galα(1,3)Gal表达的可行性。方法:采用组织植块法体外培养小鼠血管内皮细胞;经体外设计合成针对α1,3GTmRNA的序列特异性shRNA,并构建携带α1,3GT shRNA的重组慢病毒载体,以慢病毒感染小鼠血管瘤内皮细胞系EOMA;荧光实时定量PCR检测转染后α1,3GT mRNA表达水平的变化,免疫荧光检测异种抗原Galα(1,3)Gal表达水平的变化;使用SPSS 13.0 for Windows进行数据分析。结果:体外组织植块培养可获得纯度较高的小鼠血管内皮细胞;成功构建了重组慢病毒载体质粒。经病毒包装后,得到了携带α1,3GT-shRNA的成熟的重组慢病毒颗粒;荧光实时定量PCR检测显示构建的重组慢病毒转染EOMA,能抑制α1,3GT的表达,抑制率约为88%(P＜0.01)。空病毒载体对照组、阴性siRNA对照组与未处理细胞组的mRNA转录水平无显著性差异(P＞0.05);免疫荧光检测显示α1,3GT-shRNA重组慢病毒转染后细胞Galα(1,3)Gal抗原水平较对照组明显降低(P＜0.01),空病毒载体对照组、阴性siRNA对照组与未处理细胞组间的Galα(1,3)Gal抗原表达无显著性差异(P＞0.05)。结论:通过组织植块法可实现小鼠血管内皮细胞的原代培养并传代,但传代的次数有限;本实验成功构建了靶向α1,3GT基因的重组慢病毒载体,并利用该慢病毒载体成功地将α1,3GT-shRNA表达框架转导入EOMA细胞,使其持续表达,实现了靶向α1,3GT基因的RNA干扰。重组慢病毒载体有效地抑制了α1,3GTmRNA,并且抑制了其所催化的蛋白Galα(1,3)Gal的表达。通过实验,初步说明慢病毒载体介导的RNAi技术对沉默α1,3GT基因从而下调异种抗原Galα(1,3)Gal表达的策略是可行的。从而为进一步研究利用RNAi技术减轻异种移植超急性排斥反应提供了实验依据。

全文目录

中文摘要  4-5
Abstract  5-8
符号说明  8-10
前言  10-12
  研究现状、成果  10-11
  研究目的、方法  11-12
一、小鼠血管内皮细胞的原代培养  12-18
  1 对象和方法  12-15
  2 结果  15-16
  3 讨论  16-17
  4 小结  17-18
二、靶向小鼠α1,3GT-shRNA慢病毒载体的构建  18-34
  1 对象和方法  18-28
  2 结果  28-29
  3 讨论  29-33
  4 小结  33-34
三、慢病毒介导的shRNA对EOMA细胞中α1,3GT和Gal α(1,3)Gal的抑制作用  34-59
  1 对象和方法  34-50
  2 结果  50-54
  3 讨论  54-58
  4 小结  58-59
结论  59-60
参考文献  60-66
发表论文和参加科研情况说明  66-67
综述  67-76
  异种移植排斥反应及其对策研究进展  67-72
  综述参考文献  72-76
致谢  76

慢病毒介导的RNAi抑制小鼠血管内皮细胞α1，3GT表达的研究

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