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IL-6和STAT-3在胃癌中表达关系及双膦酸盐药物抑癌机制的研究

作　者: 王烨
导　师: 韩彩丽
学　校: 河北医科大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 胃癌双膦酸盐类药物 MTT法免疫组织化学免疫细胞化学流式细胞定量检测技术蛋白印迹白介素-6 p-STAT-3
分类号: R735.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

目的:在我国,胃癌是严重威胁人们健康的疾病。在肿瘤细胞增殖、浸润或转移过程中,肿瘤抗原刺激免疫细胞产生和分泌较多的内源性IL-6（interleukin-6,IL-6）,IL-6在肿瘤细胞中的过量表达又可以促进多种细胞的增殖和分化,即内源性的IL-6水平升高与肿瘤的发生、发展密切相关。IL-6的信号主要通过JAK/STATs途径与P21ras/MARK/NF-IL6途径转导至核内。在JAK/STATs途径中,IL-6主要激活信号传导与转录激活因子3（Signal Transducer and Activator of Transcription,STAT-3）,STAT-3与多种肿瘤的发生、发展密切相关。多项研究表明,STAT-3通过磷酸化激活后,可导致细胞的异常增殖和凋亡障碍,促进肿瘤的形成和发展。IL-6信号的传导是通过JAK激酶的介导作用使STAT-3发生酪氨酸磷酸化反应而活化[6]。从而形成STAT-3/3同二聚体而转入细胞核,与II型IL-6反应成分（IL-6reactive elemen,tIL-6RE）结合并诱导某些反应基因的表达。因此,在人胃癌细胞株中进行有关IL-6与p-STAT-3信号传导功能关系的研究,有助于阐明JAK/STAT信号途径在胃癌发病机制中所起的重要作用。双膦酸盐类药物（Bisphosphonates,BPs）是用于各类骨疾患及钙代谢性疾病的一类新药物,最近有研究发现BPs能抑制多种癌细胞系的生长,主要通过抑制羟戊酸旁路的关键酶——焦磷酸法尼酯合酶,减少蛋白质异戊烯化及胞内的信号蛋白的激活,同时抑制肿瘤细胞增殖。为探讨IL-6、STAT-3与胃癌发生的关系及BPs的作用机制,本研究采用免疫组织化学,Western blot方法分别检测了42例临床手术切除胃癌及相应对照组织IL-6、p-STAT-3蛋白表达。同时采用流式细胞术、免疫细胞化学染色、Western blot等方法研究分析,双磷酸盐类药物对体外培养的人胃癌细胞株IL-6、p-STAT-3蛋白表达的影响。为进一步探讨BPs的抗肿瘤作用机制及指导临床用药治疗提供实验依据。材料与方法:1材料1.1收集河北医科大学第二医院胃肠外科2006年1月-2007年12月42例手术切除新鲜胃癌组织及相应远残端黏膜部位胃组织（距肿瘤>10cm）作为对照,所有癌组织均经病理医师确定诊断证实,术前均未接受放疗或化疗。1.2人胃癌细胞株SGC-7901。1.3双膦酸盐类药物（BPs）:IB（伊班膦酸钠）;代号:Cp化合物（含氮磷键的双膦酸化合物,化学名称为[2-（6-氨基-嘌呤-9-基）-1-羟基-膦酰乙基]膦酸,后均简称Cp）。2方法2.1应用免疫组织化学技术（SP法）检测胃癌及对照组织中IL-6、p-STAT-3蛋白的表达。2.2分别提取胃癌及对照组织总蛋白采用蛋白印迹法（Western blot）检测胃癌及对照组织IL-6、p-STAT-3蛋白表达。2.3甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定各组SGC-7901细胞株的增殖情况,以确定半数抑制浓度(IC₅₀)。设立空白对照组、溶剂对照组、药物实验组;药物浓度: IB: 90、120、150、180、210μmol/L; CP: 90、120、150、180、210μmol/L。分别于药物作用72 h后测定IOD值,计算细胞生长抑制率,根据IC₅₀=Lg-1（ Xm﹣I（∑p﹣0.5））,确定IC₅₀ （IB:220μmol/L, CP :150μmol/L）。2.4两种药物以IC₅₀浓度分别作用细胞72h后收集细胞。流式细胞定量检测技术（FCM）检测细胞凋亡率的变化。2.5分别选取两种药物的三个不同浓度,IB: 160μmol/L、220μmol/L、280μmol/L; CP: 90μmol/L、150μmol/L、210μmol/L作用于SGC-7901细胞株,FCM检测药物作用24h、48h、72h后细胞周期的变化。2.6蛋白免疫印迹（Western Blot）检测两种药物以IC₅₀浓度分别作用24h、48h、72 h,细胞中IL-6,p-STAT-3蛋白的表达情况。2.7免疫细胞化学法（SP法）观察药物作用72 h细胞IL-6、p-STAT-3蛋白表达情况的变化。结果:1免疫组织化学结果IL-6主要为胞浆着棕黄色,p-STAT-3胞浆和胞核均着棕黄色。在42例对照组织中IL-6阳性表达率为9.62%（3/42）,p-STAT-3未见表达。在42例胃癌组织中IL-6和p-STAT-3表达的阳性率为73.81%（31/42）和35.71%（15/42）明显高于对照组织（P<0.05）。IL-6,p-STAT-3两种蛋白表达水平之间呈显著正相关关系（X2=10.227 P<0.05）,癌组织中IL-6蛋白表达分别与淋巴结转移、浸润深度有显著相关性（P<0.05）,在淋巴结转移或侵入浆膜的胃癌组织中,IL-6的表达阳性率明显增高;而与患者性别、肿瘤组织学类型、肿瘤分化程度无相关性（P>0.05）;p-STAT-3蛋白表达分别与淋巴结转移、肿瘤分化程度有显著相关性（P<0.05）,在淋巴结转移或分化程度低的胃癌组织中p-STAT-3蛋白表达阳性率明显增高,而与患者性别、肿瘤组织学类型、浸润深度无相关性（P>0.05）。2 Western Blot检测结果β-actin、IL-6、p-STAT3蛋白分子量为42KD、26kD、90kD,Western杂交后在相应位置出现阳性条带。采用凝胶成像分析系统对杂交条带进行半定量分析,蛋白含量以积分光密度值（IOD）表示。每次检测蛋白时均以β-actin蛋白为内参,以相对积分光密度比较蛋白表达高低。与对照组织相比,42例有33例出现胃癌组织中IL-6蛋白高表达,其高表达率为78.57%,有27例出现p-STAT3蛋白高表达,其高表达率为64.28%。3 IB、CP对SGC-7901细胞株增殖的影响两种药物均可抑制SGC-7901细胞增殖,药物浓度和作用时间不同其抑制作用不同。随着药物浓度增加,作用时间延长,抑制作用逐渐增强,210μmol/L的CP和IB作用72 h的抑制率分别达76.43%、51.71%。溶剂对照组与空白对照组细胞未见明显变化.（P>0.05）。IB的IC₅₀为220μmol/L,CP的IC₅₀为150μmol/L。4流式细胞术检测结果两种药物均可诱导SGC-7901细胞株凋亡,药物实验组SGC-7901细胞DNA直方图二倍体峰前均可见凋亡细胞特征性的亚二倍体峰（Fig.1-3）,对照组未见凋亡峰。IB组与CP组凋亡率均高于对照组（P<0.05）,提示BPs可促进胃癌细胞株凋亡,两种药物组之间细胞的凋亡率无显著差异（P>0.05）。两种药物对于细胞周期的影响均显著大于对照组（P<0.05）,随着药物作用时间的延长,药物浓度的增加,S期细胞数逐渐增加,G0/G1期和G2/M期细胞数逐渐减少。CP组作用强于IB组（P<0.05,Table 3）。由此可见,BPs可以将细胞阻滞于S期,且有明显的量效和时效关系。5免疫细胞化学结果光镜下观察IB、CP作用于SGC-7901细胞72h后, IL-6、p-STAT-3蛋白表达与对照组比较均降低。CP作用强于IB。6 Western Blot检测结果随着BPs作用时间延长IL-6,p-STAT-3蛋白表达量逐渐降低,药物作用时间与表达量呈负相关（r=-0.627,r=-0.738,P<0.05）。CP组作用强于IB组,两者与对照组比较,均有显著性差异（P<0.05）。结论:1在胃癌组织中IL-6、p-STAT-3呈现高表达,两者之间有显著正相关关系,在淋巴结转移或侵入浆膜的胃癌组织中,IL-6蛋白表达阳性率明显增高;在淋巴结转移或分化程度低的胃癌组织中p-STAT-3蛋白表达阳性率明显增高。2双膦酸盐类药物抗肿瘤作用机制为通过调节IL-6使STAT-3蛋白活化受抑制,降低磷酸化STAT-3蛋白表达,从而减低p-STAT-3细胞的促进增殖和抑制凋亡的作用,进而抑制肿瘤。3双膦酸盐类药物可诱导肿瘤细胞凋亡,还可通过延长细胞周期,抑制肿瘤细胞的增殖。4 IB与CP比较,CP对人胃癌细胞株SGC8901细胞周期的影响和降低细胞中IL-6、p-STAT-3蛋白表达的作用均明显强于IB。

全文目录

中文摘要  4-10
英文摘要  10-17
研究论文 IL-6 和STAT-3 在胃癌中表达关系及双膦酸盐药物抑癌机制的研究  17-61
  前言  17-18
  材料与方法  18-32
  结果  32-35
  附图  35-48
  附表  48-53
  讨论  53-57
  结论  57-58
  参考文献  58-61
综述细胞因子IL-6 蛋白和转录因子STAT-3 在胃癌细胞株中表达的相关性研究及双膦酸盐的抑癌机制  61-75
致谢  75-76
个人简历  76

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