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肿瘤自杀基因治疗又称药物敏感基因疗法、分子化疗或病毒介导的酶解前药疗法(VDEPT),其原理是将一些病毒或细菌基因组中前药转换酶基因(也叫自杀基因)导入肿瘤细胞,该基因编码特殊的酶,可将原先对哺乳动物细胞无毒性的前药在肿瘤细胞中代谢为毒性产物,从而引起这些细胞自杀;而在结肠癌肝转移自杀基因治疗中最长用的是胞嘧啶脱氨酶(CD)基因,可以将无化疗作用的5-氟胞嘧啶(5-FC)转化为5-氟尿嘧啶(5-FU),从而杀死结肠癌细胞,大量细胞实验已经证明CD/5-FC系统的作用,而且联合温热疗法效果更加明显;但单纯CD基因表达无靶向性,我们将由癌胚抗原(CEA)启动子(TRS)驱动表达胞嘧啶脱氨酶(CD)基因的逆转录病毒载体(G1CEACDNa)导入结肠癌细胞,在TRS的作用下CD基因只在CEA阳性的结肠癌细胞中表达,而正常组织细胞CEA为阴性,CD基因不会表达,从而避免了正常组织受5-FU的化疗损伤,提高了基因治疗的靶向性,前期细胞实验也证实了转染G1CEACDNa的结肠癌LoVo细胞比转染CD基因的LoVo细胞对5-FC的敏感性提高了19倍;在本次实验中,我们用成功转染G1CEACDNa的结肠癌LoVo细胞(LoVo-CEACD)建立结肠癌肝转移模型,用5-FC腹腔热化疗来探讨组织特异性胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)系统对裸鼠结肠癌肝转移的治疗作用,通过靶向基因治疗和热疗来提高5-FC化疗的效果,为结肠癌肝转移自杀基因治疗提供新的途径。我们将质粒G1CEACDNa在感受态细菌中大量扩增,脂质体法转染结肠癌LoVo细胞,以含G418的RPMI1640培养液筛选培养并扩增,RT-PCR检测目的基因稳定表达;将15只裸鼠随机分为三组,每组5只,分别用门静脉注射法,脾脏注射法和肝脏注射法建立结肠癌肝转移模型,每只裸鼠注射非转基因LoVo细胞1×107个,21天后处死裸鼠观察肝转移情况,发现门静脉注射法建立肝转移模型简便,有效;再将60只裸鼠随机分为对照组、单纯热疗组、5-FC热疗组和单纯5-FC化疗组,每组15只,用成功转染质粒G1CEACDNa的LoVo细胞门静脉注射法建立结肠癌肝转移动物模型,每只裸鼠注射1×107个细胞,同时对照组腹腔注射生理盐水,单纯热疗组腹腔注射43℃生理盐水,5-FC热疗组腹腔注射43℃5-FC,单纯5-FC化疗组腹腔注射不加热5-FC,注射剂量均为500mg/kg.d,连续21天,处死裸鼠观察各组裸小鼠,5-FC热疗组结肠癌肝转移率和都比较少;普通病理可见对照组肿瘤组织中,肿瘤细胞生长活跃,并可见细胞核分裂相和瘤巨细胞;而单纯热疗组和单纯5-FC化疗组肿瘤组织中,瘤细胞数减少,肿瘤细胞空泡变性,细胞核皱缩,边集甚至消失,特别是在5-FC热疗组肿瘤组织标本中更加明显,仅残留少量肿瘤细胞,并可见散在的成纤维细胞,淋巴细胞和嗜酸性粒细胞;透射电镜下可见对照组,单纯热疗组和单纯5-FC化疗组肿瘤组织肿瘤细胞呈不规则形,体积较大,核大,核仁明显,核分裂相易见,细胞浆内细胞器丰富,但无明显的凋亡小体;5-FC热疗组大量肿瘤细胞呈胞体凝缩,胞质浓缩,核糖体及线粒体聚集,细胞核固缩,核碎裂等表现,并可见大量有完整细胞膜包裹的凋亡小体,各组肿瘤标本中均有CD基因的表达。本研究得到如下结论:1.脂质体能成功将质粒G1CEACDNa转染入结肠癌LoVo细胞,并且能稳定整合持续表达。2.热疗联合组织特异性胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)系统腹腔化疗能明显减少裸鼠结肠癌肝转移瘤发生率。3.门静脉注射法更为有效的建立裸鼠结肠癌肝转移模型。4.结肠癌肝脏转移瘤组织中目的基因能够稳定表达。
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