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HCV NS5A反式激活基因NS5ATP9对肝癌细胞生长的影响

作　者: 闫记
导　师: 郑喜邦；成军
学　校: 广西大学
专　业: 临床兽医学
关键词: NS5ATP9基因实时荧光定量PCR 细胞周期细胞增殖
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
下　载: 41次
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内容摘要

丙型肝炎病毒(HCV)为单股正链RNA病毒,基因组大小约9.4kb。HCV感染后引起慢性肝炎,甚至肝硬化、肝癌。HCV基因组仅有一个开放阅读框,编码一个由3010到3033个氨基酸组成的多聚蛋白,通过细胞和病毒的蛋白酶切割,形成结构蛋白和非结构蛋白。其中非结构蛋白NS5A在HCV的致病过程中发挥重要作用。NS5A基因位于6258—7601 nt之间,编码分子量为56 kD的NS5A蛋白,位于细胞浆内。NS5A蛋白具有多种生物学功能,参与HCV多聚蛋白的成熟和RNA的复制过程;作为转录激活因子,影响细胞信号转导途径,激活多种病毒及细胞的启动子,调控细胞、病毒基因表达,调节细胞生长、凋亡以及免疫等,与感染HCV的细胞发生恶性转化过程密切相关。NS5ATP9是HCV NS5A反式激活的靶蛋白,它与细胞的凋亡、增殖及肝纤维化发生发展密切相关。为探讨HCV NS5A对细胞内NS5ATP9表达的影响,以及外源性NS5ATP9表达对肝细胞增殖和细胞周期的影响,本研究应用分子生物学技术,分别将重组质粒pcDNA3.1、pcDNA3.1-NS5A和pcDNA3.1-NS5ATP9转染HuH-7和HepG2细胞,经G418筛选,获得稳定转染的细胞克隆。采用实时定量PCR检测NS5ATP9 mRNA表达,结果表明,与对照组比较,转染pcDNA3.1-NS5A的肝细胞,NS5ATP9 mRNA表达水平显著提高;发现转染pcDNA3.1-NS5ATP9的肝细胞,通过流式细胞术检测细胞周期发现S期细胞数量显著增加,通过活细胞发光法发现显著促进肝细胞增殖。研究结果为进一步研究NS5A和NS5ATP9的相互作用及其对肝细胞细胞生物学的影响奠定基础。

全文目录

摘要  5-6
ABSTRACT  6-8
主要仪器设备  8-9
英文缩略词  9-11
目录  11-13
文献综述  13-25
  第一章 HCV病原学和流行病学研究进展  13-17
    1.1 HCV特点  13
    1.2 HCV流行病学研究进展  13-17
      1.2.1 HCV感染的分布特征  13-14
      1.2.2 HCV感染的传染源HCV  14
      1.2.3 HCV感染的传播途径  14-15
      1.2.4 HCV的易感人群  15
      1.2.5 HCV感染的预防  15-17
  第二章 NS5A和它的反式激活基因NS5ATP9的研究进展  17-25
    2.1 丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A的功能  17-20
      2.1.1 HCV NS5A基因的基因定位及结构  17-18
      2.1.2 HCV NS5A与病毒复制  18
      2.1.3 HCV NS5A对细胞周期的调节  18-19
      2.1.4 HCV NS5A在信号转导中的作用  19
      2.1.5 HCV NS5A对转录的激活  19-20
      2.1.6 HCV NS5A调节宿主细胞内的钙水平  20
    2.2 丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因的克隆化研究  20-22
    2.3 NS5ATP9基因的最新研究进展  22-25
实验研究  25-48
  第三章实时荧光定量RT-PCR方法验证NS5A表达对NS5ATP9基因表达的影响  25-39
    3.1 引言  25
    3.2 材料与方法  25-31
      3.2.1 主要材料  25
      3.2.2 主要试剂  25-26
      3.2.3 转化  26
      3.2.4 提取细菌质粒(碱裂解法)  26-27
      3.2.5 酶切鉴定  27
      3.2.6 PCR鉴定  27
      3.2.7 磁珠法小量提取质粒  27-28
      3.2.8 细胞复苏  28
      3.2.9 传代培养  28-29
      3.2.10 细胞稳定转染  29
      3.2.11 设计实时荧光定量RT-PCR引物  29
      3.2.12 总RNA提取  29
      3.2.13 实时荧光定量RT-PCR反应  29-31
    3.3 结果  31-36
      3.3.1 重组质粒的鉴定  31-32
        3.3.1.1 双酶切鉴定  31
        3.3.1.2 PCR扩增鉴定  31-32
      3.3.2 两种细胞的总RNA的完整性鉴定  32-33
      3.3.3 实时荧光定量RT-PCR结果  33-36
    3.4 讨论  36-37
    3.5 小结  37-39
  第四章外源性NS5ATP9基因对HuH-7和HepG2细胞生长的影响  39-48
    4.1 引言  39
    4.2 材料与方法  39-40
      4.2.1 材料  39-40
      4.2.2 方法  40
    4.3 结果  40-45
      4.3.1 外源性NS5ATP9基因对细胞周期的影响  40-44
      4.3.2 外源性NS5ATP9基因对细胞增值的影响  44-45
    4.4 讨论  45-47
    4.5 小结  47-48
总结及下一步研究课题  48-49
参考文献  49-55
已发表及待发表的综述及论文  55-56
致谢  56

HCV NS5A反式激活基因NS5ATP9对肝癌细胞生长的影响

内容摘要

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