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小鼠休眠胚胎的冷冻研究

作　者: 芦天罡
导　师: 刘云海
学　校: 北京农学院
专　业: 临床兽医
关键词: 小鼠休眠胚胎胚胎冷冻超微结构
分类号: S814
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

本研究对小鼠休眠胚胎与正常孵化期胚胎进行冷冻试验,目的是检验小鼠休眠胚胎抗冻能力及经过冻融后的体内外发育潜力,并观察其特殊的细胞结构和细胞器分布,为胚胎休眠技术应用于实际生产奠定基础。本研究内容分三部分。第一部分研究目的是提高小鼠休眠胚胎的制备效率,尝试用超数排卵方法来获取小鼠休眠胚胎。结果表明:见栓后注射抗PMSG组的平均出胚数(9.4枚/只)最高,显著高于其他时间注射抗PMSG实验组,常规超排处理结合注射抗PMSG血清法能有效提高小鼠休眠胚胎的回收率。试验第二部分研究目的是检验休眠胚胎冷冻后质量变化以及冻融后体内外的发育潜力。运用常规冷冻方法对正常孵化期胚胎和休眠胚胎以及冷冻效果较好的囊胚期胚胎进行冷冻,并在解冻后分别进行体外复苏培养试验和胚胎移植试验,验证胚胎经过冻融后的体内外发育潜力,同时运用双重荧光染色的方法,进行胚胎细胞计数,观察经过冷冻过程胚胎内细胞团细胞数和滋养层细胞数的变化。利用透射电子显微镜,观察小鼠休眠胚胎与正常孵化期胚胎在细胞连接和各细胞器形态与分布上的差异,以及在冻融培养后的变化。结果表明:囊胚期胚胎的冷冻解冻回收率(80.8%)极显著高于其他两组。休眠胚胎的冷冻解冻回收率(72.1%)极显著高于孵化期胚胎(50.2%)、休眠胚胎(94.2%)和囊胚期胚胎的发育率(90.9%)差异不显著,但是都极显著(p<0.01)高于孵化期胚胎(42.1%)。囊胚期胚胎的移植妊娠率(49.7%)显著高于休眠胚胎(40.8%)。休眠胚胎的移植妊娠率(40.8%)显著高于孵化期胚胎(30.1%)。休眠胚胎的内细胞团细胞数(27.83)显著高于孵化期胚胎(19.53),两种胚胎的滋养层细胞数无差异。冻融,培养后休眠胚胎的内细胞团数(25.18)显著高于孵化期胚胎(14.68),滋养层细胞数(114.09)也显著高于孵化期胚胎(73.88)。冻融,培养前后休眠胚胎内细胞团数和滋养层细胞数差异均不显著,培养后孵化期胚胎的内细胞团和滋养层细胞数都显著低于冷冻前的。利用透射电子显微镜观察各组胚胎超微结构。结果显示:两种胚胎在细胞连接,细胞核的形状,脂滴的数量与体积,内质网的形态与数量等方面都有明显差异,冻融培养后观察发现,休眠胚胎在细胞连接,细胞器形态等方面与冻融前变化明显,其在培养过程中有一个快速发育恢复的过程。试验的第三部分目的是揭示休眠胚胎冷冻效果较好的分子机理。通过RT PCR对小鼠孵化囊胚和休眠胚中的Cx43、Cx31的转录水平进行了检测,意在检验休眠胚与孵化胚缝隙连接的差异。实验收集两种类型胚胎各100枚,提取总RNA,对其进行反转录然后PCR,测定其相对于b-actin的表达量。结果显示:孵化囊胚中Cx43、Cx31的相对值低于休眠胚,但差异不显著。表明休眠胚具有和孵化胚相同的Cx43、Cx31转录水平。本实验结论:1.常规超排处理结合注射抗PMSG血清能有效提高小鼠休眠胚胎的回收率。2.小鼠休眠胚胎冻融后体内外发育潜力均优于小鼠正常孵化期胚胎。3.小鼠休眠胚胎在滋养层细胞连接、细胞核中异染色质分布、胚胎细胞中脂滴和核糖体分布上都与小鼠正常孵化期胚胎有较大差异。4.休眠胚具有与正常孵化囊胚相同的Cx31、Cx43转录水平。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-8
第一章.文献综述  8-20
  1.1 研究目的和意义  8
  1.2 胚胎延迟植入研究简史及现状  8-11
  1.3 胚胎冷冻  11-14
  1.4 双重荧光染色技术与胚胎质量鉴定  14-16
  1.5 胚胎超微结构  16-20
第二章.利用超数排卵方法高效获取小鼠休眠胚胎  20-25
  2.1 材料和方法  20-21
  2.2 实验内容  21
  2.3 统计学处理  21
  2.4 结果与分析  21-23
  2.5 讨论  23-25
第三章.小鼠休眠胚胎的冷冻实验  25-38
  试验一.小鼠休眠胚胎抗冻能力和体内外发育潜力的研究  25-32
  实验二.小鼠休眠胚冻融培养后超微结构的研究  32-38
第四章两种缝隙连接蛋白CX43 和CX31 在小鼠休眠胚胎和正常活化胚胎上的表达  38-42
  4.1 材料  38
  4.2 方法  38-40
  4.3 结果  40-41
  4.4 讨论  41-42
第五章结论  42-43
参考文献  43-50
致谢  50-57
个人简介  57

小鼠休眠胚胎的冷冻研究

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