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卤虫休眠胚胎发育过程中p90RSK途径调控细胞周期的分子机制

作　者: 戴洁琼
导　师: 杨卫军
学　校: 浙江大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 卤虫休眠胚胎发育细胞周期停滞体内活性抑制 p90核糖体S6蛋白激酶磷酸化
分类号: Q952
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

卤虫是一种生活在盐田、盐湖等高盐环境下的小型甲壳动物。为了抵抗外界极端环境的胁迫,它们进化出一种非常特殊的生殖模式,即在适宜的环境条件下,通过卵胎生方式直接产生无节幼体,而在不适宜的环境下,通过卵生方式产生休眠胚胎。这些休眠胚胎的发育停滞于原肠胚期,内部仅维持极低的代谢水平,直至休眠状态被打破。在休眠胚胎的孵化发育过程中,细胞内部发生了剧烈的变化,包括能量代谢、RNA和蛋白质的合成、细胞分化与形态发生等,以完成个体由原肠胚向前无节幼体的转变过程。然而在这一极其复杂的生理过程中,细胞分裂乃至DNA复制都是完全停止的,此时整个胚胎的细胞数始终维持在4000左右。尽管科学家们普遍认为,卤虫休眠胚胎发育过程中出现的这种细胞分化及形态发生完全独立于细胞分裂的现象对于维持胚胎的稳定性和存活能力具有重要的意义,但这一过程的相关分子机制仍然未知。本研究主要围绕卤虫休眠胚胎发育过程中p90核糖体S6蛋白激酶(RSK)途径调控细胞周期的分子机制而展开。RSK作为一种调控丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号途径下游分子活性的丝氨酸、苏氨酸激酶,广泛参与了诸如转录调控、细胞周期调节、细胞存活等细胞内大量生理活动的调节过程。本研究首先分析了RSK分子在卤虫胚胎和幼虫发育过程中的表达和活性,又通过一系列体内蛋白活性抑制实验确认了RSK激酶活性对于细胞周期调控和有丝分裂发生的作用。在此基础上,我们又针对卤虫RSK的分子结构与功能活性,以及卤虫RSK途径的上下游作用分子等进行了鉴定研究。此外,我们利用高等动物细胞系和爪蟾系统等表达卤虫RSK分子,由此比较分析了卤虫RSK与其它物种RSK的结构功能区别。研究结果显示,RSK分子在卤虫各个生长发育时期均有表达,但仅在休眠胚胎发育后期的前无节幼体出壳阶段才被磷酸化激活。此时,RSK的活化过程恰与胚胎细胞恢复有丝分裂的过程同时发生。一旦在卤虫胚胎发育过程中抑制RSK活性,幼体就会出现严重的生理缺陷,表现为胸腹部区域出现大量组织空腔。利用BrdU对分裂细胞进行标记和检测的结果证实了这些缺陷部位的细胞有丝分裂活性明显受到抑制。在此作用途径中,RSK激酶的活化伴随着上游ERK激酶的活化而发生,并且卤虫RSK分子中含有ERK结合序列的C末端区域对于激酶活化至关重要。在此途径的下游,RSK可能与卤虫休眠胚胎特异性表达的小分子热休克蛋白p26存在一定的相互关系。此外,在爪蟾卵母细胞的成熟过程中,卤虫RSK分子能够诱导卵母细胞提前发生生发泡破裂现象,但无法促使其完成整个成熟过程,致使卵母细胞长时间停滞在初始阶段,出现黏化、干瘪等现象。本研究由此表明,RSK途径在卤虫休眠胚胎发育过程中参与了G2/M细胞周期停滞的终止以及有丝分裂发生等调控过程,这对于幼虫的生长至关重要。此结果不但为进一步揭示卤虫休眠胚胎特殊发育模式的分子机制奠定了理论基础,而且还扩展了RSK这一重要蛋白激酶的功能新领域。

全文目录

致谢  5-6
摘要  6-8
ABSTRACT  8-11
插图和附表清单  11-13
缩略词和术语表  13-15
目次  15-18
第1章绪论  18-29
  1.1 研究背景  18-28
    1.1.1 卤虫概况  18-19
    1.1.2 卤虫休眠胚胎的发育过程  19
    1.1.3 p90核糖体S6蛋白激酶研究概况  19-20
    1.1.4 p90核糖体S6蛋白激酶的分子结构及生化特征  20-21
    1.1.5 p90核糖体S6蛋白激酶活化的分子机制  21-23
    1.1.6 p90核糖体S6蛋白激酶的作用底物及主要功能  23-27
    1.1.7 无脊椎动物中p90核糖体S6蛋白激酶的研究进展  27-28
    1.1.8 展望  28
  1.2 研究目的、方法和意义  28-29
第2章卤虫p90核糖体S6蛋白激酶的表达及活性分析  29-56
  2.1 引言  29-30
  2.2 材料  30-31
    2.2.1 实验材料  30-31
    2.2.2 主要试剂  31
    2.2.3 主要仪器  31
  2.3 方法  31-43
    2.3.1 总RNA提取及cDNA合成  31-33
    2.3.2 卤虫p90核糖体S6蛋白激酶基因的分子克隆  33-38
    2.3.3 半定量RT-PCR  38-39
    2.3.4 Western Blotting  39-41
    2.3.5 免疫组织化学  41-42
    2.3.6 DNA含量与细胞周期分析  42-43
  2.4 结果  43-53
    2.4.1 卤虫RSK基因的分子克隆与特征分析  43-46
    2.4.2 RSK基因在卤虫生殖发育过程中的表达状况  46-47
    2.4.3 RSK蛋白在卤虫休眠胚胎及幼虫发育过程中的活性分析  47-49
    2.4.4 RSK激酶活性与细胞周期停滞的关系  49-53
  2.5 小结与讨论  53-56
    2.5.1 RSK分子典型C末端的缺失  53-54
    2.5.2 卤虫RSK分子的表达与活化  54
    2.5.3 卤虫休眠胚胎细胞周期停滞的时期  54-56
第3章 p90核糖体S6蛋白激酶途径在卤虫胚胎及幼虫发育过程中的功能研究  56-90
  3.1 引言  56-57
  3.2 材料  57-59
    3.2.1 实验材料  57
    3.2.2 主要试剂  57-58
    3.2.3 主要仪器  58-59
  3.3 方法  59-76
    3.3.1 双链RNA的制备  59-63
    3.3.2 卤虫胚胎显微注射  63
    3.3.3 定量PCR  63-65
    3.3.4 免疫组织化学  65
    3.3.5 BrdU的标记与检测  65-66
    3.3.6 有丝分裂观察  66
    3.3.7 RSK分子突变体的构建  66-68
    3.3.8 细胞培养  68-69
    3.3.9 细胞转染  69-70
    3.3.10 免疫共沉淀  70
    3.3.11 卤虫p26基因的分子克隆及相关表达载体的构建  70-73
    3.3.12 Pull down检测  73-75
    3.3.13 银染  75
    3.3.14 Western blotting  75-76
  3.4 结果  76-87
    3.4.1 RSK活性对卤虫胚胎和幼虫发育过程中细胞有丝分裂的影响  76-80
    3.4.2 卤虫RSK分子结构与突变体活性  80-82
    3.4.3 卤虫RSK途径的上下游分子  82-87
  3.5 小结与讨论  87-90
    3.5.1 卤虫休眠胚胎及幼虫发育过程中的RSK活性与有丝分裂发生  87-89
    3.5.2 参与卤虫休眠胚胎发育过程中细胞周期调控的RSK途径  89-90
第4章卤虫p90核糖体S6蛋白激酶在爪蟾系统中的功能研究  90-101
  4.1 引言  90-91
  4.2 材料  91-92
    4.2.1 实验材料  91
    4.2.2 主要试剂  91-92
    4.2.3 主要仪器  92
  4.3 方法  92-97
    4.3.1 体外转录  92-94
    4.3.2 爪蟾胚胎的显微注射  94-95
    4.3.3 爪蟾卵母细胞的显微注射  95-96
    4.3.4 Western blotting  96-97
  4.4 结果  97-99
    4.4.1 卤虫RSK分子在爪蟾胚胎中的表达活性  97-98
    4.4.2 卤虫RSK分子对爪蟾卵母细胞成熟的影响  98-99
  4.5 小结与讨论  99-101
    4.5.1 卤虫RSK在爪蟾胚胎发育早期的表达活性  99-100
    4.5.2 卵母细胞成熟过程中卤虫RSK与爪蟾RSK的功能比较  100-101
结论与展望  101-103
参考文献  103-113
本研究的创新点  113-114
附录常用试剂配制一览表  114-121
作者简历  121-122

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