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植物激素脱落酸受体的表达，纯化和晶体学研究

作　者: 樊鹤
导　师: 施一公
学　校: 清华大学
专　业: 生物学
关键词: ABA受体 PYL/PYR/RCAR PP2C 晶体结构
分类号: Q946
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

植物激素是高等植物体内产生的一种化学物质,具有重要的生理功能,是植物整个生命活动中不可缺少的。其中脱落酸(Abscisic acid, ABA)是一种非常重要的天然植物激素,也是最早得到确认的五大植物激素之一。ABA在高等植物中调控着一系列不同的生理和发育过程,如促进叶、花、果的脱落,诱导芽和块茎的休眠,抑制种子发芽,促进气孔关闭,提高植物抗逆性等。然而,尽管ABA分子已经被发现了半个世纪,但对于它的受体及作用机制一直以来并不清楚。近年来学术界报导了多种类型的ABA受体、如FCA、CHLH,GCR2等,但由于数据解释以及生物手段等原因,一直倍受争议。2009年4月份,两个独立的实验小组同时在Science杂志上发表了类似的成果,即在拟南芥中被命名为PYR/PYL/RCAR的蛋白被鉴定为ABA受体,在结合ABA之后会与下游效应蛋白(磷酸酶PP2C)相互作用并抑制其磷酸酶活性进而影响其生命活动。鉴于这一发现的重大意义以及综合考虑ABA受体鉴定长期以来的争议,我们选择了该课题,以期获得ABA受体相关的三维空间机构,从而为PYR/PYL/RCAR等是否是真正的ABA受体提供最为直接有力的证据,并且将从对原子水平上对ABA与受体结合并发挥相关功能的机制作出解释。在本课题研究过程中,我们克隆了ABA受体PYL/PYR/RCAR及其下游PP2C相关的基因,分别重组到原核表达载体(PET系列),在Escherichia coil中高效表达,通过单个基因表达以及不同基因组合共表达纯化的方法,获得了高纯度的蛋白。然后,采取悬滴气相扩散法对单个蛋白以及蛋白复合物筛选并不断优化的结晶条件,获得了可以用作收集数据的高质量晶体,再通过重原子浸泡和分子置换等方法使晶体的相位问题得到解决,最终得到了ABA受体PYL系列蛋白的三种状态下的高分辨率分子结构,包括1)没有结合ABA,2)结合ABA,3)同时结合ABA和下游PP2C的复合体。通过比较发现:PYLs蛋白的‘ligand-binding pocket’可以结合ABA。这种结合导致PYLs蛋白发生构象变化并识别结合下游效应蛋白PP2C,从而影响植物的生理活动。这些研究成果为后期的农业生产上的应用奠定了基础。

全文目录

摘要  2-3
Abstract  3-8
主要符号对照表  8-9
第1章引言  9-23
  1.1 脱落酸（ABA）及其受体的研究背景  9-17
    1.1.1 植物激素及其受体介绍  9-10
    1.1.2 ABA 的发现及其功能  10-11
    1.1.3 ABA 受体的研究进展  11-13
    1.1.4 ABA 信号通路下游蛋白的研究进展  13-17
      1.1.4.1 植物体内蛋白磷酸酶的介绍和分类  13-15
      1.1.4.2 PP2C 在ABA 信号途径中的作用  15-17
  1.2 结构生物学研究手段  17-20
    1.2.1 蛋白结构生物学的介绍  17-18
    1.2.2 蛋白质X 射线晶体学简介  18-20
  1.3 本文研究的主要内容和主要贡献  20-23
    1.3.1 研究内容  20-21
    1.3.2 本文的主要贡献  21-23
第2章 ABA 受体和PP2C 的克隆、表达和纯化  23-43
  2.1 基因克隆、表达和纯化介绍  23-29
    2.1.1 基因的克隆和表达  23-27
    2.1.2 蛋白的分离纯化  27-29
  2.2 实验材料  29-31
    2.2.1 质粒和菌株  29-30
    2.2.2 分子生物学相关的生化试剂  30
    2.2.3 蛋白表达纯化所需试剂  30-31
    2.2.4 实验仪器  31
  2.3 实验方法  31-42
    2.3.1 原核表达载体的构建  31-35
      2.3.1.1 基因片段的克隆和酶切  31-32
      2.3.1.2 酶切产物的回收、连接和纯化  32-33
      2.3.1.3 重组质粒的鉴定  33-35
    2.3.2 蛋白表达  35-38
      2.3.2.1 ABA 受体PYL 系列蛋白表达  35-36
      2.3.2.2 PYL 系列蛋白和 PP2C 复合物共表达  36
      2.3.2.3 硒代蛋白的表达  36-38
    2.3.3 蛋白纯化  38-42
      2.3.3.1 ABA 受体PYL 系列蛋白纯化  38-39
      2.3.3.2 PYL 系列蛋白和 PP2C 复合物纯化  39-42
  2.4 本章小结  42-43
第3章 ABA 受体及其与 PP2C 复合物的结晶和晶体学研究  43-52
  3.1 可溶蛋白结晶策略  43-49
    3.1.1 常用结晶方法  43-44
    3.1.2 晶体生长及优化  44-49
      3.1.2.1 可溶蛋白结晶的影响因素  45-46
      3.1.2.2 初筛之后结晶条件优化的常用思路  46-47
      3.1.2.3 结晶后晶体质量提高的处理方法  47-49
  3.2 PYL 系列蛋白以及与PP2C 复合物的结晶  49-51
    3.2.1 试剂和仪器  49
    3.2.2 结晶方法及实验结果  49-51
  3.3 本章小结  51-52
第4章相位解析和衍射数据的收集处理  52-61
  4.1 相位解析方法引言  52-55
    4.1.1 相位解析方法介绍  52-53
    4.1.2 重原子衍生物的获取  53-55
  4.2 材料和方法  55-56
    4.2.1 试剂和材料  55
    4.2.2 实验方法  55-56
  4.3 衍射数据的收集和处理  56-61
    4.3.1 X-Ray 单晶衍射技术的进展  56-59
      4.3.1.1 X 射线光源的进展—同步辐射光源  56-58
      4.3.1.2 X 射线探测器的进展  58-59
    4.3.2 衍射数据的收集和处理  59-61
第5章从结构和生化实验对 ABA 信号通路的机制解释  61-79
  5.1 Apo-PYL2 的结构解析  61-62
  5.2 (+)-ABA-bound PYL2 的结构及相关比较  62-66
    5.2.1 ABA-PYL2 的结构解析  62-65
    5.2.2 Apo-PYL2 和ABA-PYL2 的结构比较  65-66
  5.3 ABA-bound PYL2-A811 的结构解析  66-69
  5.4 生化实验  69-73
    5.4.1 PYL2 二聚体相关的生化分析  69-70
    5.4.2 PYL2 和ABA 识别的生化分析  70-71
    5.4.3 (+)-ABA–bound PYL1 和A811 识别的生化分析  71-73
  5.5 ABA-PYL1 抑制 A811 活性的机制和相关讨论  73-79
第6章结论与讨论  79-80
参考文献  80-85
致谢  85-86
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果  86

植物激素脱落酸受体的表达，纯化和晶体学研究

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