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皱褶假丝酵母（Candidarugosa）脂肪酶基因的克隆与表达

作　者: 江雪青
导　师: 闫云君；徐莉
学　校: 华中科技大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 皱褶假丝酵母脂肪酶基因克隆 lipJ08 表达
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

近年来,脂肪酶的工业化应用领域越来越宽,获取更多具有不同特性的脂肪酶及其基因资源,并实现规模化生产,成为生物技术的研发热点。皱褶假丝酵母(Candida rugosa,原名Candida cylindracea)脂肪酶(CRL)是脂肪酶中较为重要的品种之一,可以催化脂水解、酯交换、酯合成等反应,广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化等工业领域中,其含有多个同工酶,性质特异,并均能在异源宿主中实现一定程度的表达、分泌,具有较好的发展前景。本文从皱褶假丝酵母(ATCC 14830)菌株出发,以总DNA基因组为模板扩增出六个脂肪酶基因(lip1-lip5和lipJ08)。其中,基因lipJ08的全长序列为首次报道。同时,通过置换17个非常规丝氨酸密码子,实现了lipJ08基因在巴斯德毕赤酵母(GS115)中的异源表达。主要工作如下:(1)借助生物信息学,对已克隆的皱褶假丝酵母脂肪酶全长基因序列进行同源比对,根据保守序列设计引物,在基因组DNA水平上,从皱褶假丝酵母(ATCC 14830)菌株中克隆得到六个脂肪酶基因(lip1-lip5和lipJ08),其中lip1-lip5序列与已报道的皱褶假丝酵母脂肪酶同工酶相同, lipJ08基因为皱褶假丝酵母脂肪酶新的同工酶基因。序列分析表明,lipJ08基因全长为1650 bp,编码549个氨基酸,包括一个含15个氨基酸残基的信号肽,成熟脂肪酶由534个氨基酸组成。(2)由于C.rugosa脂肪酶基因中存在非通用密码子CTG,编码Ser,而在毕赤酵母中则编码Leu。因此,使得以Ser为脂肪酶活性中心的皱褶假丝酵母脂肪酶异源表达时得到的是没有催化活性的表达产物。利用重叠延伸PCR(Over-lap extension PCR)技术对lipJ08中的17个CTG位点进行了突变改造,转换为在毕赤酵母中编码Ser的TCT,突变基因命名为MlipJ08。(3)将lipJ08和MlipJ08分别亚克隆到表达载体pPIC9K中,成功构建了表达质粒pPIC9K-lipJ08和pPIC9K-MlipJ08,并将表达载体电转导入巴斯德毕赤酵母(GS115)中,成功地得到分泌表达。SDS-PAGE结果显示,表达的LIPJ08和MLIPJ08的分子量大小约为60 kDa。酶学特性研究表明,经密码子改造后获得的重组脂肪酶MLIPJ08对橄榄油的水解活力达4.65 U/mL,而LIPJ08活力几乎检测不到;MLIPJ08的最适温度为37℃,最适pH为7.0,对长碳链(C16)和短碳链(C4)pNp酯的水解活力高于对中碳链C8、C10和C12 pNp酯。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-10
1 前言  10-22
  1.1 脂肪酶概述  10-14
  1.2 皱褶假丝酵母脂肪酶  14-17
  1.3 毕赤酵母表达系统  17-20
  1.4 本课题的研究意义  20-22
2 皱褶假丝酵母脂肪酶基因的克隆  22-39
  2.1 实验材料  22-24
  2.2 实验方法  24-32
  2.3 结果与分析  32-37
  2.4 讨论  37-38
  2.5 小结  38-39
3 表达质粒pPIC9k-lipJ08、pPIC9k-MlipJ08 的构建及其在毕赤酵母中的表达  39-54
  3.1 实验材料  39-40
  3.2 实验方法  40-47
  3.3 结果与分析  47-52
  3.4 讨论  52-53
  3.5 小结  53-54
致谢  54-55
参考文献  55-61
附录 1 攻读硕士期间发表论文目录  61-62
附录 2  62-63

皱褶假丝酵母（Candidarugosa）脂肪酶基因的克隆与表达

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