学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

小鼠IL-33的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备与应用研究

作　者: 柳晓金
导　师: 李明才
学　校: 汕头大学
专　业: 免疫学
关键词: 白细胞介素-33 基因克隆 表达 多克隆抗体 类风湿性关节炎
分类号: R392.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 171次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


白细胞介素(IL)-33是2005年Schmitz等使用计算机序列分析、发现并鉴定的一种前炎症细胞因子。它的基因序列和结构与IL-1家族成员IL-1β和IL-18最为相似,属于IL-1家族的一个新成员,也被称为IL-1F11。IL-33 mRNA在小鼠胃、肺、脊髓、脑、皮肤等组织及静止树突状细胞、活化的巨噬细胞高表达,在人平滑肌细胞及支气管或小气道上皮细胞为组成性表达。IL-33与其受体ST2结合,活化核因子(NF)-κB和丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK),诱导辅助性T细胞(Th)2细胞因子的产生,在多种炎症与免疫过程中发挥重要作用。目前,关于IL-33功能的研究在国内外都尚处于发展阶段。本研究用分子生物学技术克隆小鼠IL-33基因,通过构建其真核及原核表达载体、原核表达系统表达IL-33蛋白及其兔抗多克隆抗体的制备,探讨小鼠IL-33蛋白在不同组织中的表达分布及IL-33在不同疾病动物模型中的作用,为进一步研究其功能奠定了基础。本文主要研究内容如下:一、根据GenBank中小鼠IL-33基因序列(No. AY905582)设计特异性引物,用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)技术,克隆出IL-33基因的全长编码区。将其克隆入pcDNA3.1(+)载体,构建其真核表达载体pcDNA3.1(+)-mIL-33,之后将该表达载体转化入大肠杆菌TOP10中,经菌落PCR、酶切鉴定及序列测序,得知它与GenBank中的序列完全一致,为IL-33基因的表达研究奠定了基础。二、根据小鼠IL-33基因序列设计特异性引物,用PCR技术,克隆出IL-33成熟蛋白编码区,将其克隆入载体pET-44,构建原核表达载体pET-44-mIL-33,经测序鉴定其编码基因与GenBank中的序列一致。将该表达载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)中获得表达菌株,然后在25°C用IPTG诱导,表达的融合蛋白以可溶性蛋白及包涵体形式存在。用镍离子亲和层析法纯化以可溶性形式存在的目的蛋白,经凝胶图像分析确定其纯度可高达95%以上。细胞增殖实验结果表明,重组IL-33蛋白具有抑制细胞增殖的活性,且其活性比标准品高。三、利用纯化的IL-33蛋白,免疫新西兰白兔,制备兔抗小鼠IL-33多克隆抗体, ELISA结果显示,该多克隆抗体效价高达1:32 000;Western blot结果显示,该多克隆抗体可以与小鼠IL-33蛋白特异性结合。免疫组织化学染色结果显示,小鼠IL-33蛋白分布于支气管上皮细胞及肝细胞的细胞质或细胞核中。四、在IL-33与类风湿关节炎关系的研究中发现,抗IL-33多克隆抗体可减轻关节炎体征及关节腔内炎症细胞的浸润。总之,IL-33基因的克隆、成熟蛋白的原核表达、多克隆抗体的制备及对IL-33与类风湿性关节炎等炎症与免疫性疾病关系的初步探讨,为进一步进行IL-33的理论研究及临床应用研究奠定了基础。

全文目录


中文摘要  10-12
Abstract  12-14
缩略词表  14-16
前言  16-25
  1 IL-33 发现与命名  16
  2 IL-33 的分子结构和编码蛋白  16
  3 IL-33 产生及调节  16-17
  4 IL-33 受体及信号传导  17-18
    4.1 受体基因结构及表达  17
    4.2 受体蛋白结构  17-18
    4.3 信号转导途径  18
  5 IL-33 生物学活性及其在相关疾病中的作用  18-20
  6 本研究的目的和内容  20
  参考文献  20-25
第1章 小鼠IL-33 基因的克隆及序列分析  25-38
  1 材料与方法  25-32
    1.1 材料  25-27
      1.1.1 质粒、菌株和实验动物  25
      1.1.2 主要试剂  25
      1.1.3 主要仪器  25-26
      1.1.4 培养基  26
      1.1.5 主要溶液  26-27
      1.1.6 RNA操作有关溶液的配置和处理  27
      1.1.7 RNA操作有关器皿的处理  27
    1.2 方法  27-32
      1.2.1 引物设计与合成  27-28
      1.2.2 小鼠脊髓总RNA提取  28-29
      1.2.3 RT-PCR扩增  29
      1.2.4 胶回收纯化目的基因片段  29
      1.2.5 PCR产物的克隆连接  29-30
      1.2.6 感受态细胞的制备  30
      1.2.7 转化  30-31
      1.2.8 表达载体的构建  31
      1.2.9 菌落PCR鉴定  31-32
      1.2.10 重组质粒的小量快速制备及酶切法鉴定  32
      1.2.11 重组质粒的序列分析  32
  2 结果  32-35
    2.1 小鼠脊髓总RNA制备及RT-PCR扩增  32
    2.2 质粒构建  32-33
    2.3 菌落PCR鉴定  33
    2.4 重组质粒的酶切法鉴定  33-35
    2.5 重组质粒的序列分析  35
  3 讨论  35-36
  参考文献  36-38
第2章 小鼠IL-33 的原核表达、纯化与鉴定  38-49
  1 材料与方法  38-43
    1.1 材料  38-41
      1.1.1 质粒与细胞  38
      1.1.2 主要试剂  38-39
      1.1.3 主要仪器  39
      1.1.4 主要溶液  39-41
    1.2 方法  41-43
      1.2.1 引物设计与合成  41
      1.2.2 mIL-33 成熟蛋白基因的PCR扩增  41
      1.2.3 表达载体的构建  41
      1.2.4 工程菌的诱导表达  41-42
      1.2.5 重组蛋白mIL-33 可溶性分析  42
      1.2.6 重组蛋白的分离纯化  42
      1.2.7 目的蛋白的含量与SDS-PAGE分析  42
      1.2.8 Western blot分析  42-43
      1.2.9 mIL-33 的生物学活性分析  43
  2 结果  43-46
    2.1 表达载体的构建  43-44
    2.2 融合蛋白的诱导表达  44
    2.3 重组蛋白的纯化  44-45
    2.4 重组蛋白的鉴定  45
    2.5 m IL-33 的活性分析  45-46
  3 讨论  46-47
  参考文献  47-49
第3章 兔抗小鼠IL-33 多克隆抗体的制备、纯化及鉴定  49-58
  1 材料与方法  49-53
    1.1 材料  49-50
      1.1.1 实验动物  49
      1.1.2 主要试剂  49
      1.1.3 主要仪器及设备  49
      1.1.4 主要溶液  49-50
    1.2 方法  50-53
      1.2.1 小鼠IL-33 蛋白的原核表达、纯化及鉴定  50-51
      1.2.2 抗血清的制备  51
      1.2.3 ELISA检测抗血清效价  51
      1.2.4 多克隆抗体的纯化  51-52
      1.2.5 免疫印迹分析  52
      1.2.6 免疫组织化学检测  52-53
  2 结果  53-55
    2.1 m IL-33 蛋白的原核表达、纯化及鉴定  53
    2.2 ELISA检测抗血清效价及抗体的纯化  53
    2.3 免疫印迹分析  53
    2.4 免疫组织化学检测  53-55
  3 讨论  55-56
  参考文献  56-58
第4章 抗IL-33 抗体在类风湿性关节炎中的作用  58-65
  1 材料与方法  58-60
    1.1 材料  58-59
      1.1.1 实验动物  58
      1.1.2 主要试剂  58-59
      1.1.3 主要仪器  59
      1.1.4 主要溶液  59
    1.2 方法  59-60
      1.2.1 CIA模型建立及抗IL-33 多克隆抗体注射  59-60
      1.2.2 流式细胞术(Flow cytometry，FCM)检测小鼠脾脏CD4+CD25+T细胞亚群  60
      1.2.3 组织病理学分析  60
  2 结果  60-62
    2.1 Ⅱ型胶原诱导的C57BL/6 小鼠关节炎及抗IL-33 抗体对CIA模型关节炎症的影响  60-61
    2.2 FCM检测小鼠脾脏CD4+CD25+T细胞亚群  61-62
    2.3 组织病理学分析  62
  3 讨论  62-63
  参考文献  63-65
结论  65-66
附录A 抗IL-33 抗体抑制哮喘气道炎症  66-77
  1 材料与方法  66-70
    1.1 材料  66-67
      1.1.1 实验动物  66
      1.1.2 主要试剂  66-67
      1.1.3 主要仪器  67
      1.1.4 主要溶液  67
    1.2 方法  67-70
      1.2.1 小鼠哮喘模型的制作及抗IL-33 多克隆抗体的注射  67-68
      1.2.2 肺泡灌洗液的收集及细胞计数与分类  68-69
      1.2.3 组织病理学分析  69
      1.2.4 血清中IgE抗体水平的检测  69-70
      1.2.5 统计学处理  70
  2 结果  70-72
    2.1 鼻腔给药方法的可行性分析  70
    2.2 抗IL-33 多克隆抗体对哮喘模型气道炎症的影响  70
    2.3 组织病理学分析  70
    2.4 肺泡灌洗液中细胞因子的检测  70-71
    2.5 血清中IgE抗体水平的检测  71-72
  3 讨论  72-73
  参考文献  73-77
附录B 抗IL-33 抗体在小鼠EAE的作用  77-85
  1 材料与方法  77-79
    1.1 材料  77-78
      1.1.1 实验动物  77
      1.1.2 主要试剂  77
      1.1.3 主要仪器  77-78
    1.2 方法  78-79
      1.2.1 小鼠EAE模型的诱导  78
      1.2.2 pcDNA3.1-mIL-33 质粒及抗IL-33 多克隆抗体的注射  78
      1.2.3 血清收集及脾脏细胞培养上清细胞因子检测  78-79
      1.2.4 组织病理检查  79
      1.2.5 统计学处理  79
  2 结果  79-81
    2.1 小鼠发病情况  79-80
    2.2 细胞因子的检测  80-81
    2.3 组织切片的HE (hematoxylin-eosin)及LFB染色  81
  3 讨论  81-83
  参考文献  83-85
致谢  85-86
攻读硕士学位期间研究成果  86-87
个人简历  87

相似论文

  1. 多转录因子组合调控研究,Q78
  2. 高校艺术教学建筑设计研究,TU244.3
  3. 时间表达式识别与归一化研究,TP391.1
  4. 拟南芥胱硫醚-γ-合成酶（D-AtCGS）基因在大肠杆菌中的表达及抗血清制备,Q943.2
  5. 红肉脐橙和‘国庆四号’温州蜜柑中CHS和CHI基因的克隆与表达及其对类黄酮积累的调控机制,S666.4
  6. 拟南芥热激因子HSFA1d响应甲醛胁迫的作用研究,Q945.78
  7. hBMP4和hBMP7在中国仓鼠卵巢细胞中的表达研究,Q78
  8. 南极冰藻GPx、GST和SAHH基因的克隆、定量分析及原核表达载体的构建,Q943.2
  9. 草鱼呼肠孤病毒vp5、vp7基因cDNA的克隆、表达及VP5、VP7蛋白亚细胞定位研究,S941.41
  10. 草鱼呼肠孤病毒vp6和ns38基因的克隆、表达及VP6和NS38免疫原性研究,S941.41
  11. Pin1在骨肉瘤细胞中的表达及对细胞周期的影响,R738.1
  12. BMP通路关键因子在人类牙胚组织中的表达检测,R78
  13. 《庄子》修辞策略探析,B223.5
  14. Gsα的过表达和缺失对果蝇大脑发育的影响,Q75
  15. 基于RNA测序技术的马氏珠母贝珍珠囊转录组及数字基因表达谱分析,Q786
  16. 磷酸化介导的UGT1A3代谢活性差异的初步研究,R346
  17. 军曹鱼生长激素基因（GH）的克隆和表达,Q786
  18. 企鹅珍珠贝Cd-MT酶联免疫检测方法的建立及试剂盒的初步研制,X835
  19. 稳定表达人有机阴离子转运多肽OATP1B1野生型及其突变体的HEK-293细胞系的构建,R96
  20. 论语文教师教学表达力,G633.3
  21. 条纹斑竹鲨和鲫鱼BAFF基因的克隆和性质分析,S917.4

中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学 > 免疫生物学
© 2012 www.xueweilunwen.com