学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

新酪啡肽Fmoc固相合成及其活性的检测

作　者: 符友伟
导　师: 吴蕾
学　校: 天津商业大学
专　业: 发酵工程
关键词: 酪啡肽 Fmoc固相合成液相色谱和质谱镇痛抗疲劳
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 52次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

阿片肽(Opioid peptide)是一种神经免疫肽,可分为内源性阿片肽和外源性阿片肽,对中枢神经系统及外周器官均起作用。从已发现的外源性阿片肽的数量来看,很大一部分都来源于酪蛋白。它们以无活性的状态存在于酪蛋白中,当通过酶解才会从酪蛋白前体物中水解出来。本研究中的所要合成的酪啡肽来源于酪蛋白Alpha-S1 -casein的144-158序列,其序列为YFYPELFRQFYQLDA,分子量为:2252.48。由于该酪啡肽序列较短,利用Fmoc固相合成法可以方便的制备,确定合成的工艺为:以Wang树脂为固相载体,从C端向N端合成,Fmoc-氨基酸为原料,二氯甲烷(DCM)为反应溶剂,O-苯并氮唑-N,N,N’N’-四甲基脲四氟硼酸酯/1-羟基苯并三氮唑(HOBt)/N,N-二异丙基乙胺(DIEA)为缩合体系,进行逐步固相合成。合成完成后进行切割反应,试剂为三氟乙酸/水/苯甲硫醚/石碳酸(TFA/H2O/thioanisole/Phenol)体系(85: 5: 5: 5);切割时间2h;切割温度为24℃。得到的滤液用无水醚沉淀,冷冻干燥,可得到酪啡肽的白色粗产品,得率为57.7%。粗产品经Sephadex G-15进行分离纯化,得到两个峰,经检测发现,第一个峰具有活性,再将第一个峰经高效液相色谱-质谱联用,进行分子量测定。从色谱分析图中可知纯度达43%。合成肽的分子量为2253.4,与酪啡肽的理论值基本一致。为了检测合成的酪啡肽是否具有生物学活性,实验中采用了热板法和醋酸扭体实验分别检测其镇痛活性。结果表明合成的酪啡肽不仅具有中枢镇痛活性,还具有外周镇痛的活性。小鼠负重游泳实验也证明了该肽具有抗疲劳的作用。经spss软件t检验分析,合成的酪啡肽与水解获得的酪啡肽对小鼠痛阈都有明显的提高,两者在显著水平p=0.05下,中枢镇痛和抗疲劳效果没有显著差异,说明它们都有镇痛与抗疲劳的作用,且效果无显著差异。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-9
第一章前言  9-23
  1.1 阿片肽概述  9-15
    1.1.1 一级结构  10-11
    1.1.2 构象特征  11-12
    1.1.3 与免疫系统的关系  12-13
    1.1.4 与镇痛的关系  13
    1.1.5 与神经系统的关系  13
    1.1.6 对心血管系统的影响  13-14
    1.1.7 对胃肠道的影响  14
    1.1.8 对内分泌的影响  14
    1.1.9 其它功能  14-15
  1.2 固相合成法简述  15-21
    1.2.1 固相合成的基本原理与方法  15-16
    1.2.2 载体的选择  16-19
    1.2.3 氨基酸的保护策略  19-20
    1.2.4 缩合剂的选择  20-21
  1.3 课题展开依据  21-22
  1.4 课题展开的意义  22-23
第二章材料和方法  23-32
  2.1 酪啡肽固相手动合成条件的确立  23-26
    2.1.1 材料  23
    2.1.2 实验仪器  23
    2.1.3 方法  23-26
  2.2 酪啡肽粗产品的柱层析分离纯化  26-27
    2.2.1 实验材料  26
    2.2.2 实验仪器  26
    2.2.3 实验方法  26-27
  2.3 合成酪啡肽的高效液相色谱-质谱(HPLC-MC)法分析  27-28
    2.3.1 实验仪器  27
    2.3.2 实验方法  27-28
    2.3.3 样品预处理  28
    2.3.4 HPLC 检测条件  28
  2.4 酪啡肽的中枢镇痛活性检测  28-30
    2.4.1 热板法原理  28-29
    2.4.2 实验材料  29
    2.4.3 实验仪器  29
    2.4.4 实验方法  29-30
  2.5 酪啡肽外周镇痛效果检测  30
    2.5.1 扭体实验原理  30
    2.5.2 实验材料与仪器  30
    2.5.3 实验方法  30
  2.6 酪啡肽的抗疲劳作用  30-32
    2.6.1 实验材料与仪器  30-31
    2.6.2 实验方法  31-32
第三章结果  32-56
  3.1 酪啡肽固相合成条件的确定  32-37
    3.1.1 接肽反应时间的确定  32-33
    3.1.2 洗涤方法的确定  33-35
    3.1.3 切割条件的确定  35-37
  3.2 葡聚糖凝胶柱层析  37
  3.3 HPLC-MC 分析  37-38
  3.4 酪啡肽中枢镇痛效果的检测结果  38-44
    3.4.1 热板法检测数据  38-41
    3.4.2 SPSS 检验结果  41-44
  3.5 酪啡肽外周镇痛效果的检测结果  44-45
    3.5.1 实验前准备  44
    3.5.2 扭体实验数据  44-45
    3.5.3 SPSS 软件t 检验  45
  3.6 合成肽与天然酪啡肽间中枢镇痛作用的比较  45
  3.7 抗疲劳试验结果  45-46
  3.8 分析与讨论  46-56
    3.8.1 保护策略的选择  47
    3.8.2 反应溶剂的选择  47-48
    3.8.3 缩合剂的选择  48
    3.8.4 脱保护剂的选择  48-49
    3.8.5 缩合效果检测方法  49-50
    3.8.6 洗涤方法  50
    3.8.7 多肽下树脂方法  50-51
    3.8.8 粗产品的分离纯化与鉴定  51-53
    3.8.9 合成肽活性的检测  53-56
第四章结论  56-58
  4.1 酪啡肽Fmoc 固相合成条件  56
  4.2 Sephadex G-15 柱层析分离条件  56
  4.3 HLPC-MS 分析结果  56-57
  4.4 中枢镇痛结果  57
  4.5 外周镇痛结果  57
  4.6 负重游泳结果  57
  4.7 合成肽与天然酪啡肽之间比较  57-58
第五章展望  58-59
  5.1 进一步工作设想  58
  5.2 展望  58-59
参考文献  59-64
发表论文、参加科研情况说明  64-66
附录主要符号说明  66-67
致谢  67-68

新酪啡肽Fmoc固相合成及其活性的检测

内容摘要

全文目录

相似论文