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猪囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶TsCL-1基因的原核表达及生物学特性研究

作　者: 宋军科
导　师: 于三科；才学鹏
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶纯化活性免疫原性
分类号: S852.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

猪囊尾蚴(Cysticercus cellulosae)是猪带绦虫的中绦期,是造成猪囊尾蚴病的病原。在人体内,猪带绦虫与两个明显的感染阶段有关:肠道感染(这是由于猪带绦虫的成虫在宿主肠道寄生所致,也称绦虫病)和肌肉或组织感染(是由于猪带绦虫的幼虫――囊尾蚴进入宿主肌肉或者组织内所致,也称囊虫病)。因此,该病是一种危害严重、分布广泛的人兽共患寄生虫病。半胱氨酸蛋白酶方泛分布于从病毒至脊椎动物生物体中,在细胞凋亡和肿瘤发生中具有重要作用。在寄生虫的发育和生存过程中,半胱氨酸蛋白酶除具有催化和蛋白加工功能外,还在寄生虫成囊、组织侵袭、营养摄取、免疫逃避和致病性等方面起重要作用。尤其值得注意的是,该酶具有较好种特异性,既可作为寄生虫病的诊断抗原和疫苗候选分子,同时,也是药物治疗寄生虫病的靶标。鉴于此,本研究针对猪囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶开展研究。1.将猪囊尾蚴半胱氨蛋白酶pGEX-4T-TsCL-1重组质粒转化的BL21(DE3)宿主菌进行诱导表达。SDS-PAGE分析表明:猪囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶在大肠埃希菌中得到高效表达,重组蛋白以可溶性和包涵体两种表达形式存在,重组TsCL-1蛋白相对分子量约为61Ku。与预期的结果相符。2.对重组蛋白诱导条件进行了优化,发现在28℃,IPTG浓度0.1 mmol/L诱导10h后融合蛋白的表达量较高。通过蛋白质分析专家系统(Expert Protein Analysis, ExPASY)对猪囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶的结构与功能分析预测。结果表明该序列保守性较强,为偏碱性的蛋白,在氨基酸组成中,以非极性疏水性氨基酸数量居多;PI值为8.17,蛋白质的二级结构中有30.0%的α-螺旋结构,24.5%的β-折叠,无规则卷曲19.5%,转角31.0%。3.用GST琼脂糖凝胶亲和层析法纯化重组TsCL-1可溶性蛋白。SDS-PAGE后薄层扫描分折,纯化后的目的蛋白纯度可达90%以上。利用明胶电泳对蛋白的活性进行分析,发现纯化蛋白由于聚丙烯酰胺凝胶内的明胶产生了水解。导致染色液中的色素没有蛋白与之相结合。经染色、脱色后,在目的蛋白相应迁移位置出现了白色条带,其他位置则呈蓝色。将半胱氨酸蛋白酶用特异性抑制剂E-64处理后经SDS-PAGE分析发现,在凝胶内相应的迁移位置呈现与背景色一致的蓝色,这说明样品中酶的活性被抑制,失去了水解明胶的活性。由此可知所纯化的可溶性重组TsCL-1蛋白具有生物活性,其水解活性能被半胱氨酸蛋白酶特异性抑制剂E-64所抑制。4.开展了重组蛋白的免疫原性研究。用表达的目的蛋白免疫5周龄的雌性昆明系小鼠后,分离小鼠的血清并用间接ELISA法测定效价,抗体滴度可达1:12 800;用Western blot对抗体的特异性分析发现,在61ku位置出现特异的蛋白杂交带,而与阴性血清没有杂交条带产生,证明制备的抗体能与TsCL-1重组蛋白特异性结合。以上研究说明TsCL-1重组蛋白有较好的免疫原性和抗原性。为猪囊尾蚴病的诊断与检测提供了一种简便﹑快捷﹑价格低廉的技术手段。通过以上研究,初步明确了猪囊尾蚴半胱氨蛋白酶的生物学特性和免疫原性,为明确寄生虫与宿主相互关系及进一点开展猪囊尾蚴病的免疫诊断和治疗的研究奠定了基础。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-12
文献综述  12-25
  第一章猪囊尾蚴病的诊断与防治研究进展  12-21
    1.1 猪囊尾蚴病概述  12-15
      1.1.1 猪囊尾蚴病的流行病学  12-13
      1.1.2 猪带绦虫生活史  13-14
      1.1.3 猪囊尾蚴病的危害  14-15
    1.2 猪囊虫病诊断的研究进展  15-18
      1.2.1 猪囊尾蚴病诊断方法的研究进展  15-16
      1.2.2 猪囊尾蚴病诊断抗原的研究进展  16-18
    1.3 猪囊尾蚴病防治的研究进展  18-21
      1.3.1 猪囊尾蚴病的治疗  18-20
      1.3.2 猪囊尾蚴病的免疫预防  20-21
  第二章寄生虫半胱氨酸蛋白酶的研究进展  21-25
    2.1 寄生虫半胱氨酸蛋白酶的来源及存在的部位  21-22
    2.2 寄生虫半胱氨酸蛋白酶的分泌机制  22
    2.3 半胱氨酸蛋白酶在寄生虫免疫逃避，营养获得与移行方面的研究  22-23
      2.3.1 半胱氨酸蛋白酶在寄生虫免疫逃避中的作用  22-23
      2.3.2 半胱氨酸蛋白酶在寄生虫获取营养与移行中的作用  23
    2.4 其他方面  23-25
      2.4.1 半胱氨酸蛋白酶对寄生虫生殖力的影响  23-24
      2.4.2 半胱氨酸蛋白酶在寄生虫脱包囊、脱鞘和羽化中的作用  24
      2.4.3 半胱氨酸蛋白酶的免疫原性  24-25
试验研究  25-54
  第三章猪囊尾蚴TSCL-1 基因诱导表达条件的优化及表达蛋白的结构预测  25-37
    3.1 材料  27-28
      3.1.1 重组质粒和菌种  27
      3.1.2 试剂  27
      3.1.3 仪器与设备  27
      3.1.4 培养基和溶液的配制  27-28
    3.2 方法  28-30
      3.2.1 重组质粒pGEX-4T-TsCL-1 诱导表达  28
      3.2.2 表达产物的SDS-PAGE 检测  28-29
      3.2.3 表达条件的优化  29-30
      3.2.4 TsCL-1 基因编码蛋白组成及结构的预测  30
    3.3 结果与分析  30-34
      3.3.1 TsCL-1 基因表达产物SDS-PAGE 分析  30-31
      3.3.2 不同诱导条件下重组蛋白诱导表达情况  31-33
      3.3.3 猪囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶氨基酸组成分析  33-34
      3.3.4 编码蛋白的三级结构预测  34
    3.4 讨论  34-37
  第四章猪囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶TSCL-1 的纯化及其酶活分析  37-47
    4.1 材料  37-38
      4.1.1 菌种和试剂  37-38
      4.1.2 培养基和溶液的配制  38
    4.2 方法  38-41
      4.2.1 GST- pGEX-4T-TsCL-1 高效表达产物的纯化  38-39
      4.2.2 纯化蛋白的浓缩  39
      4.2.3 纯化GST- pGEX-4T-TsCL-1 蛋白分析  39-40
      4.2.4 重组表达蛋白的水解活性和抑制性检测  40-41
    4.3 结果  41-44
      4.3.1 GST- pGEX-4T-TsCL-1 高效表达产物的纯化  41
      4.3.2 纯化蛋白的浓缩结果  41-43
      4.3.3 重组表达蛋白的水解活性和抑制性检测  43-44
    4.4 讨论  44-47
  第五章猪囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶TSCL-1 免疫活性分析  47-54
    5.1 材料  47-48
      5.1.1 抗原及实验动物  47
      5.1.2 试剂和耗材  47-48
      5.1.3 溶液  48
      5.1.4 仪器设备  48
    5.2 方法  48-50
      5.2.1 pGEX-4T-TsCL-1 融合蛋白的制备  48-49
      5.2.2 蛋白含量的测定  49
      5.2.3 抗体的制备  49
      5.2.4 抗体效价的测定  49-50
      5.2.5 pGEX-4T-TsCL-1 可溶性蛋白的Western blot 分析  50
    5.3 结果与分析  50-51
      5.3.1 蛋白含量  50
      5.3.2 抗体的鉴定及效价测定  50-51
    5.4 讨论  51-54
参考文献  54-63
缩略词表  63-65
致谢  65-66
作者简介  66

猪囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶TsCL-1基因的原核表达及生物学特性研究

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