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酒石酸诺卡氏菌发酵产顺式环氧琥珀酸水解酶的研究

作　者: 彭亮亮
导　师: 王云山
学　校: 河北大学
专　业: 微生物学
关键词: L(+)-酒石酸酒石酸诺卡氏菌顺势环氧琥珀酸水解酶酶活测定
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目前,工业上生产L(+)-酒石酸主要采用生物合成法,即利用顺式环氧琥珀酸水解酶(ESH)作为催化剂,将底物顺式环氧琥珀酸(ES)转化生成L(+)-酒石酸。本论文从应用的角度出发,对酒石酸诺卡氏菌高产ESH菌株进行了筛选,并研究了其发酵特性,优化了发酵培养基,建立了一种快速测定ESH酶活的新方法。本论文主要进行了以下几方面研究:1.高产菌株的筛选:将工厂提供的菌株通过分离纯化获得50个菌株,经生长和产酶能力测定从中筛选出15支活性较高的菌株,再通过多次传代复筛后,得到了两株活性较高且产酶稳定的菌株,其总酶活较出发菌株提高了21-30%。2.酒石酸诺卡氏菌发酵特性研究研究考察了酒石酸诺卡氏菌发酵过程中碳源、氮源、pH等主要控制参数和细胞量、总酶活、比酶活的变化特性。结果表明,当发酵培养基中同时含有葡萄糖和丙二醇时,葡萄糖作为优先碳源首先被利用;随着葡萄糖代谢副产物有机酸的积累导致pH下降,当葡萄糖耗尽后,发酵液pH开始上升;菌体的诱导产酶期位于对数生长期,此时发酵液中有L(+)-酒石酸生成,但菌体并不利用产生的酒石酸。在这一条件下,整个发酵周期约为40 h,菌体浓度可达30 g/L,酶活力可达515 U/g。3.快速测定ESH酶活方法的建立以酒石酸诺卡氏菌细胞超声破碎液为材料,通过对转化生成L(+)-酒石酸过程中的底物浓度,酶浓度,转化时间的正交实验研究,建立了一种快速检测细胞ESH酶活的新方法。即1 g湿细胞,30 mL 0.2 mol/L的ES,37℃保温转化10 min,通过HPLC测定酒石酸含量来计算酶活。此方法具有快速、准确、细胞用量少的特点。4.酒石酸诺卡氏菌发酵培养基的优化通过单因子实验,考察了碳源种类与浓度,ES浓度与添加时间,产物酒石酸对发酵产ESH的影响。研究表明,菌体生长的最佳碳源为葡萄糖,产ESH的最佳碳源为蔗糖,两者的最适浓度均为5 g/L;当ES浓度小于40 g/L时,ES对菌体生长没有抑制作用,ES的最适浓度为20 g/L;在菌体生长到对数期添加ES可以提高菌体的产酶量。实验还发现,酒石酸可延缓菌体利用ES的速率,从而延长了ESH的诱导产生期。综合以上条件,将培养基优化后,菌体总酶活较优化前提高了22.8%。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-13
第1章文献综述  13-20
  1.1 L(+)-酒石酸简介  13
  1.2 L(+)-酒石酸的酶法合成  13-15
    1.2.1 酶法合成L(+)-酒石酸的反应机理  14
    1.2.2 酶法合成L(+)-酒石酸的影响因素  14-15
  1.3 顺式环氧琥珀酸水解酶  15-17
    1.3.1 ESH 的来源  15
    1.3.2 酒石酸诺卡氏菌的产ESH 的影响因素  15
    1.3.3 ESH 的固定化  15-16
    1.3.4 ESH 的酶活测定方法  16-17
  1.4 酒石酸的测定方法  17-18
    1.4.1 偏矾酸铵比色法  17
    1.4.2 5-硝基水杨酸比色法  17
    1.4.3 旋光法  17-18
    1.4.4 高效液相色谱法  18
  1.5 酒石酸诺卡氏菌  18-19
  1.6 本论文的研究意义和目的  19-20
第2章酒石酸诺卡氏菌菌种筛选  20-26
  2.1 引言  20
  2.2 实验材料  20-21
    2.2.1 菌株来源  20
    2.2.2 培养基  20
    2.2.3 仪器与试剂  20-21
  2.3 实验方法  21-22
    2.3.1 菌种的分离纯化  21
    2.3.2 菌种筛选  21
    2.3.3 分析方法  21-22
  2.4 实验结果与讨论  22-25
    2.4.1 酒石酸标准曲线  22-23
    2.4.2 初筛结果  23-24
    2.4.3 复筛结果  24-25
    2.4.4 遗传稳定性检测  25
  2.5 小结  25-26
第3章酒石酸诺卡氏菌发酵特性研究  26-34
  3.1 引言  26
  3.2 实验材料  26
    3.2.1 菌株  26
    3.2.2 培养基  26
    3.2.3 主要仪器及试剂  26
  3.3 实验方法  26-28
    3.3.1 培养方法  26-27
    3.3.2 分析方法  27-28
  3.4 实验结果与讨论  28-33
    3.4.1 葡萄糖标准曲线的绘制  28
    3.4.2 丙二醇标准曲线的绘制  28-29
    3.4.3 诺卡氏菌生长曲线  29-30
    3.4.4 发酵过程中培养基成分的变化规律  30
    3.4.5 发酵过程中pH 的变化规律  30-31
    3.4.6 发酵过程中酒石酸的含量变化  31-32
    3.4.7 发酵结果  32-33
  3.5 小结  33-34
第4章酒石酸诺卡氏菌ESH 酶活测定方法的改进  34-40
  4.1 引言  34
  4.2 实验材料  34-35
    4.2.1 菌株  34
    4.2.2 培养基  34
    4.2.3 主要仪器与试剂  34-35
  4.3 实验方法  35-36
    4.3.1 培养方法  35
    4.3.2 样品的制备  35
    4.3.4 ESH 酶活测定  35
    4.3.5 L(+)-酒石酸的检测  35-36
    4.3.6 酶活力的定义及转化率计算方法  36
    4.3.7 酶活测定最佳条件的确立原则  36
  4.4 实验结果与讨论  36-39
    4.4.1 不同处理方法对细胞ESH 酶活的影响  36-38
    4.4.2 正交实验设计及结果  38-39
  4.5 小结  39-40
第5章酒石酸诺卡氏菌发酵培养基的优化  40-52
  5.1 引言  40
  5.2 实验材料  40-41
    5.2.1 菌株  40
    5.2.2 培养基  40
    5.2.3 主要仪器与试剂  40-41
  5.3 实验方法  41-42
    5.3.1 培养方法  41
    5.3.2 碳源对菌体生长和产酶的影响  41
    5.3.3 ES 和酒石酸对菌体生长和产酶的影响  41-42
    5.3.4 分析方法  42
  5.4 实验结果与讨论  42-50
    5.4.1 ES 的标准曲线  42-44
    5.4.2 碳源对酒石酸诺卡氏菌生长和产酶的影响  44-47
    5.4.3 ES 和酒石酸对酒石酸诺卡氏菌生长和产酶的影响  47-50
    5.4.4 优化工艺设计及结果  50
  5.5 小结  50-52
结论  52-53
参考文献  53-57
致谢  57-58
攻读学位期间取得的科研成果  58

酒石酸诺卡氏菌发酵产顺式环氧琥珀酸水解酶的研究

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