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禽B型白血病病毒生物学特性的分析及研究

作　者: 石文慧
导　师: 刘艳琴；杨润德
学　校: 河北农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 禽白血病病毒理化特性分离鉴定 PCR/RFLP技术
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

禽白血病(avian leukosis,AL)是指由反转录病毒科甲型反转录病毒属禽反转录病毒引起的以禽类造血组织中某些细胞成分过度增生为主的各种可传染的肿瘤性疾病。此病以禽淋巴细胞性白血病和肉鸡的髓细胞性白血病较为常见。本病以垂直和水平传播两种方式在世界各国鸡群中广泛流行,引起鸡死亡和消瘦、生长和发育不良,同时引起机体抵抗力下降和免疫抑制,是危害养禽业的主要疾病之一。近年来,国外一些养殖业较发达的国家通过淘汰患病鸡群,减少垂直传播从而达到净化种群的目的。在我国一些地区均有本病发病报道,且有流行趋势。本研究主要是从河北保定地区某种鸡场疑似骨石症的发病成年蛋用种鸡病料中分离到一株病毒,经PCR鉴定、生物学特性的鉴定及PCR/RFLP分析确定为B亚群禽白血病病毒,并对该分离毒株对新城疫抗体水平的影响做了初步的研究。无菌采集患骨石症的成年蛋用种鸡病料,将其肝、脾研磨后,用灭菌生理盐水做3倍稀释,12000 rpm离心5 min,取上清接种于11日龄发育良好的SPF鸡胚绒毛尿囊膜上。由于禽白血病病毒在绒毛尿囊膜上不产生细胞病变,接种7天后收毒,盲传至三代。根据GenBank上已发表的禽白血病病毒P27基因序列,设计并合成了一对扩增P27基因序列的特异性引物,对原始病料及鸡胚毒提取DNA,经PCR扩增,得到746 bp特异性的核酸片段。本研究采用PCR方法测定禽白血病病毒(ALV)分离毒的EID50,并基于此方法对理化特性进行研究。试验结果表明:该毒株病毒液在pH3和60℃被完全灭活,在pH12作用1 hr后及经氯仿处理后EID50差值均大于2,表明该毒株对pH4.5以下的酸、热及碱均高度敏感;对胰蛋白酶敏感;且说明该病毒有囊膜。试验结果均符合ALV生物学特性。ALV的囊膜基因gp85区在各亚群间存在差异,但在同一亚群不同毒株间有高度的保守,因此可以通过比较其gp85来确定其所属亚群。通过对A、B、E亚群gp85区的多态性酶切位点分析发现,A亚群具有SspⅠ、BglⅡ酶切位点;B亚群具有BamHⅠ酶切位点;E亚群具有SspⅠ酶切位点。在本研究中,首先选择Smith等针对pol基因的3′端和gp85编码基因的内部设计的一对J亚群ALV特异性引物进行PCR扩增,结果没有扩增出目的条带,证明该分离株不属于J亚群禽白血病病毒。然后参考刘公平等针对病毒囊膜基因gp85区两侧的保守序列设计的引物扩增出了1.2kb的目的片段,并经BglⅡ、BamHⅠ酶切,分离毒株只能被BamHⅠ限制酶切开,这表明该分离毒株为B亚群禽白血病病毒。本试验通过对普通鸡胚所携带的内源性禽白血病病毒env基因进行扩增SspⅠ、BglⅡ酶切分析及同源性对比和发育树分析,证明本试验所采用的PCR/RFLP技术用于ALV亚群的分型鉴定是有效的。将该分离毒病毒液经皮下接种于1日龄雏鸡,然后再进行新城疫免疫。试验显示,攻毒试验组的新城疫抗体水平明显低于正常对照组,表明该毒株可以引起鸡一定程度的免疫抑制。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-9
1 前言  9-21
  1.1 概述  9
  1.2 病原生物学研究  9-13
    1.2.1 病毒基因组结构  10
    1.2.2 gag 基因及其编码结构蛋白  10
    1.2.3 病毒囊膜基因及受体  10-12
    1.2.4 病毒复制  12
    1.2.5 对理化因素的抵抗力  12-13
  1.3 ALV 分型  13-14
  1.4 ALV 的致瘤机制  14-15
  1.5 ALV 与免疫抑制  15-16
  1.6 ALV 流行病学特点  16-17
    1.6.1 传播  16
    1.6.2 感染特征  16-17
    1.6.3 流行特点  17
  1.7 症状及病理变化  17-19
    1.7.1 淋巴细胞性白血病（lymphocytic leukosis，LL）  17
    1.7.2 成红细胞年性白血病（erthroblastosis，EB）  17
    1.7.3 成髓细胞性白血病（myeloblastosis，MB）  17-18
    1.7.4 骨石化病（osteopetrosis，OP）  18-19
  1.8 ALV 分型鉴定方法  19-20
    1.8.1 抵抗力诱发因子试验（RIF）  19
    1.8.2 病毒中和试验（neutralization，NT）  19
    1.8.3 免疫荧光检测方法（IFA）  19
    1.8.4 病毒核酸检测试验  19-20
  1.9 本研究的目的和意义  20-21
2 材料与方法  21-30
  2.1 毒株  21
  2.2 试验动物  21
  2.3 主要试剂和材料  21-23
    2.3.1 DNA 提取所需主要试剂  21
    2.3.2 聚合酶链式反应（PCR）所需主要试剂  21-22
    2.3.3 血球凝集试验—血球凝集抑制试验（HA-HI）所需主要试剂  22
    2.3.4 主要试剂的配制方法  22-23
  2.4 主要仪器  23
  2.5 病毒的分离及生物学特性的鉴定  23-26
    2.5.1 病料的处理  23
    2.5.2 PCR 检测  23-25
    2.5.3 病毒的增殖  25
    2.5.4 病毒毒价测定（50% Egg Infectious Dose,EID＿(50)）  25
    2.5.5 理化特性鉴定  25-26
  2.6 J 亚群特异性引物PCR 扩增  26
    2.6.1 DNA 样品制备  26
    2.6.2 PCR 引物设计  26
    2.6.3 PCR 扩增  26
  2.7 应用PCR/RFLP 技术进行分型  26-28
    2.7.1 PCR 扩增  26-27
    2.7.2 PCR 产物酶切  27
    2.7.3 对PCR/RFLP 技术的验证试验  27-28
  2.8 ALV 分离株对鸡体新城疫抗体水平的影响及卡介苗对该影响的干扰作用  28-30
    2.8.1 试验分组  28
    2.8.2 接毒  28
    2.8.3 血球凝集试验—血球凝集抑制试验（HA-HI）  28-29
    2.8.4 数据分析  29-30
3 试验结果  30-47
  3.1 禽白血病病毒（ALV）的分离及生物学特性的鉴定  30-38
    3.1.1 PCR 检测结果  30
    3.1.2 PCR 产物测序结果  30-32
    3.1.3 ALV 的EID_(50) 结果  32-33
    3.1.4 理化特性鉴定结果  33-38
  3.2 J 亚群特异性引物PCR 扩增结果  38-39
  3.3 应用PCR/RFLP 技术进行分型研究实验结果  39-45
    3.3.1 PCR 扩增结果  39
    3.3.2 PCR 产物酶切鉴定结果  39-40
    3.3.3 对PCR/RFLP 技术的验证试验结果  40-45
  3.4 ALV 分离株对鸡体新城疫抗体水平的影响及卡介苗干扰作用试验结果  45-47
4 讨论  47-49
5 结论  49-50
参考文献  50-56
作者简介  56-57
在读期间发表的论文  57-58
致谢  58-59

禽B型白血病病毒生物学特性的分析及研究

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