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穿心莲内酯衍生物抗H_2O_2诱导的胰岛细胞RIN-mβ凋亡的蛋白组学研究

作　者: 周辉华
导　师: 何庆瑜
学　校: 暨南大学
专　业: 遗传学
关键词: 穿心莲内酯衍生物AL-1 胰岛RIN-mβ细胞蛋白质组学 Akt/PKB ERK 抗氧化抗凋亡
分类号: R285
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的：用蛋白组学的方法研究穿心莲内酯衍生物AL-1抗H202诱导的胰岛RIN-mp细胞损伤的作用分子机理。方法：以400μM的H2O2作用于胰岛RIN-mβ细胞4h建立细胞凋亡模型,采用四氮唑蓝还原法(MTT)测定细胞生长存活率；碘化丙啶(PI)染色流式细胞技术(FCM)检测细胞凋亡率；荧光显微镜观察细胞凋亡形态的变化。采用蛋白组高通量技术,提取加药组(AL-1)(浓度为0.1μM,处理时间1 h)和对照组(Control)(加相应浓度的DMSO,处理时间1 h)总蛋白,双向凝胶电泳(2-DE)分离蛋白质,银染,ImageMaster 2D Platinum软件分析2D图谱,获得差异表达蛋白,质谱鉴定差异蛋白。用生物信息学方法对差异蛋白进行功能分类。用Westernblot方法,验证了RHO GDP-Dissociation 1, EF-Tu,14-3-3ζ等差异蛋白的变化。分析AL-1对胰岛RIN-mβ细胞的信号转导通路的影响。应用蛋白组学分析鉴定了处理组(AL-1+ H2O2)(0.1μM AL-1预孵1h,400μM H2O2作用4 h)与对照组(H2O2)(400μM H2O2作用4 h)凋亡蛋白差异的变化。结果：1)穿心莲内酯衍生物AL-1提高了H202处理的胰岛RIN-mβ细胞的存活率。2)建立了单独AL-1作用前后RIN-mβ细胞系的双向凝胶电泳图谱,鉴定了Thioredoxin, Peroxiredoxin-1, Peroxiredoxin-5, Glutaredoxin-3,14-3-3ζ, DJ-1, Hsp90ab1, HnrnpA2/B1, EF-Tu等在内的72个差异蛋白分子。这些蛋白涉及到糖代谢、核酸代谢、蛋白质代谢和修饰、信号转导、细胞凋亡、细胞结构和运动、免疫和防御等细胞生理过程相关的蛋白变化。发现处理组(AL-1+H2O2)与对照组(H202)中促进凋亡蛋白Isoform 3 of Programmed cell death 6-interacting protein, Galectin-1, Nuclear mitotic apparatus protein 1等都发生下调,抑制凋亡的蛋白Prohibitin, Heat shock protein 9, Hspa5, Isoform 1 of 60kDa heat shock protein等都发生上调。3)基于蛋白质组学的结果,进一步分析了AL-1通过激活Akt和ERK信号转导通路,诱导抗氧化蛋白和抗凋亡蛋白的表达,从而阐明了AL-1抗H202诱导胰岛细胞损伤和凋亡的作用分子机理。结论：本实验分析了AL-1处理胰岛RIN-mβ细胞前后细胞内蛋白质表达水平的变化,初步解释AL-1保护胰岛RIN-mp细胞的作用分子机理。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-6
缩略词表  6-7
目录  7-9
第一章前言  9-14
  1.1 氧化应激的概述  9
  1.2 糖尿病氧化应激的产生  9
  1.3 氧化应激对糖尿病的影响  9-10
  1.4 抗氧化治疗的应用前景  10-12
    1.4.1 穿心莲内酷及其抗氧化作用  10-11
    1.4.2 硫辛酸及其生物学作用  11-12
  1.5 蛋白质组学及蛋白质组学技术  12-14
    1.5.1 蛋白组概述  12
    1.5.2 蛋白组学研究技术  12-14
第二章技术路线  14-15
第三章材料与方法  15-33
  3.1 主要材料  15
    3.1.1 细胞系  15
    3.1.2 穿心莲内酯衍生物AL-1  15
  3.2 主要试剂  15-17
    3.2.1 细胞培养  15
    3.2.2 双向电泳试剂  15-16
    3.2.3 质谱鉴定试剂  16
    3.2.4 Western-blot试剂  16-17
    3.2.5 其他试剂  17
  3.3 生物信息学软件  17
  3.4 主要仪器  17-18
  3.5 相关溶液的配制  18-24
    3.5.1 双向电泳试剂配制  18-21
    3.5.2 银染染色液(以下配制均为两块胶用量)  21
    3.5.3 蛋白质酶解及质谱溶液  21-22
    3.5.4 Western blot试剂配方  22-24
  3.6 实验方法  24-31
    3.6.1 细胞培养  25
    3.6.2 MTT实验  25
    3.6.3 荧光显微镜检测细胞凋亡  25
    3.6.4 流式细胞术检测细胞凋亡  25-26
    3.6.5 用药胰岛RIN-mβ细胞培养  26
    3.6.6 细胞总蛋白裂解和提取  26
    3.6.7 Bradford法测定蛋白浓度  26-27
    3.6.8 二维电泳  27-28
    3.6.9 图像扫描与分析  28-29
    3.6.10 差异表达蛋白质酶解  29
    3.6.11 质谱鉴定  29-30
    3.6.12 差异表达蛋白质的功能分类  30
    3.6.13 AL-1处理前后胰岛RIN-mβ细胞蛋白变化的Western Blot验证  30-31
  3.7 荧光酶标仪检测AL-1处理前后胰岛RIN-mβ细胞内活性氧(ROS)的变化  31
  3.8 Western blot检测AL-1对Akt,ERK信号通路的影响  31
  3.9 蛋白质的网络关系图  31
  3.10 AL-1抗H_2O_2诱导的细胞凋亡作用  31
  3.11 统计学处理  31-33
第四章结果  33-49
  4.1 MTT检测AL-1对细胞的保护作用  33
  4.2 AL-1减轻H_2O_2导致的凋亡核型变化  33-34
  4.3 细胞仪检测AL-1降低H_2O_2导致的胰岛RIN-mβ细胞凋亡  34-35
  4.4 AL-1对H_2O_2所致胰岛RIN-mβ细胞损伤抗氧化蛋白表达的影响  35-36
  4.5 Bradford法测蛋白浓度  36-37
  4.6 AL-1处理胰岛RIN-mβ细胞前后的2-DE结果  37-38
  4.7 差异蛋白质的质谱鉴定  38-40
  4.8 差异蛋白的功能分类  40-42
  4.9 Western blot验证2DE结果中的部分差异蛋白  42-43
  4.10 AL-1调节抗氧化蛋白实现抗凋亡的作用  43
  4.11 AL-1处理胰岛RIN-mβ细胞后ROS的变化  43-44
  4.12 活性氧ROS的来源  44
  4.13 Akt/PKB,ERK与鉴定的蛋白质的网络关系图  44-45
  4.15 AL-1激活AKT,ERK信号转导通路  45-46
  4.16 AL-1抗H_2O_2诱导的细胞凋亡作用  46-49
第五章讨论与结论  49-58
  5.1 穿心莲内酯衍生物AL-1对H_2O_2诱导的胰岛RIN-mβ细胞凋亡保护作用  49
  5.2 药物AL-1处理后胰岛RIN-mβ细胞蛋白质组学的变化及意义  49-55
    5.2.1 Thioredoxin(Trx),Peroxiredoxin(Prx)等抗氧化蛋白  49-51
    5.2.2 Gclm  51
    5.2.3 14-3-3  51-52
    5.2.4 RHO-GDI 1  52-53
    5.2.5 DJ-1  53-54
    5.2.6 hnRNP A_2B_1  54
    5.2.7 HSP  54-55
  5.3 AL-1增强NAD(P)H氧化酶活性导致ROS升高,激活Akt,ERK细胞信号转导通路  55-56
  5.4 AL-1保护作用的机理  56-58
第六章总结  58-59
参考文献  59-65
附录  65-67
在学期间发表文章  67-68
致谢  68

穿心莲内酯衍生物抗H_2O_2诱导的胰岛细胞RIN-mβ凋亡的蛋白组学研究

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