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人胃癌及癌旁来源的间质干样细胞分离鉴定及其差异比较

作　者: 许晓蒙
导　师: 许文荣
学　校: 江苏大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: 间质干细胞 胃癌组织 癌旁组织 肿瘤微环境
分类号: R735.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


目的探讨胃癌患者组织中是否能分离培养出胃癌间质干样细胞(mesenchymal stem cells-like cells from human gastric cancer,hGC-MSCs)及癌旁间质干样细胞(mesenchymal stem-like cells fromhuman gastric cancer adjacent non-cancerous tissues,hGCN-MSCs),鉴定其生物学特性,并且进行两者间差异比较。方法采用组织块贴壁法分离培养120例胃癌患者的胃癌及癌旁组织,在含有10%胎牛血清,低糖DMEM培养基中培养、增殖并进行传代。通过测定生长曲线、细胞周期、流式分析表面标记、染色体分析等,对其进行形态学、细胞与分子遗传学分析;提取细胞株的总RNA,并逆转录成cDNA,检测干细胞相关基因的表达情况;成脂成骨诱导实验检测干细胞的多潜能分化能力;免疫组织化学在蛋白水平上验证hGC-MSCs和hGCN-MSCs中α-SMA、CK18、PCNA、P53、ABCG2及SALL4的表达水平差异;Transwell迁移实验检测两者迁移能力的差异;染色体分析、裸鼠致瘤实验检测其干细胞特性和致瘤特性。结果组织块贴壁法分离培养120例胃癌患者胃癌及癌旁组织,共分离培养出35株hGC-MSCs和22株hGCN-MSCs细胞,其中配对样本细胞株11对,实验采用配对细胞株进行分析鉴定。生长曲线、细胞周期检测显示hGC-MSCs增殖速率明显高于hGCN-MSCs;流式分析表面标记显示hGC-MSCs和hGCN-MSCs均表达干细胞相关标记:CD29、HLA-1、CD105;但不表达CD14、CD31、CD34、CD71;hGC-MSCs CD44、CD13表达阳性,而hGCN-MSCs CD44、CD13表达阴性;RT-PCR检测显示两者均表达干细胞相关基因:Oct-4、Nanog、Bmi-1、Nucleostemin、ABCG2,以及间质干细胞相关基因:CD44、CD73、α-SMA、TGF-β、VEGF和IGF;hGC-MSCs、hGCN-MSCs均高表达N-cadherin但不表达E-cadherin;hGC-MSCs高表达而hGCN-MSCs低表达或不表达MDM2、p21、SALL4等基因;染色体分析、裸鼠致瘤实验及成骨成脂诱导实验结果表明hGC-MSCs及hGCN-MSCs具有正常间质干细胞的特性;免疫组化分析显示hGC-MSCs及hGCN-MSCsα-SMA、CK18、PCNA、P53、ABCG2及SALL4染色阳性;Transwell迁移实验显示hGC-MSCs迁移率高于hGCN-MSCs。结论采用组织块贴壁法成功分离培养了人胃癌间质干样细胞(hGC-MSCs)与人癌旁间质干样细胞(hGCN-MSCs),体外增殖、分化试验、染色体分析和裸鼠体内致瘤试验证实了该细胞具有正常间质干细胞的特性。二者在细胞形态、基因表达、及多潜能分化能力上具有相似性,但在细胞表面标志、细胞周期及增殖性相关基因的表达等方面具有较明显的差异,其差异原因可能与间质干样细胞可构成肿瘤基质微环境,并对胃癌的发生及发展起的相互作用有关。

全文目录


摘要  6-8
ABSTRACT  8-14
第一章 绪论  14-21
  1.1 间质干细胞  14-18
    1.1.1 间质干细胞生物学特性及应用  14-15
    1.1.2 间质干细胞的来源  15-17
    1.1.3 间质干细胞的临床应用  17-18
  1.2 肿瘤组织与间质干细胞的研究  18-21
    1.2.1 肿瘤中的间质干细胞  18-19
    1.2.2 间质干细胞突变致瘤  19
    1.2.3 肿瘤组织募集间质干细胞  19-21
第二章 研究目的、方法、实验设计方案和意义  21-24
  2.1 研究目的  21
  2.2 研究方法  21-22
  2.3 实验设计方案  22-23
  2.4 研究意义  23-24
第三章 人胃癌及癌旁来源的间质干样细胞分离鉴定及其差异比较  24-47
  3.1 实验材料  24-26
    3.1.1 病例来源及标本采集  24-25
    3.1.2 主要试剂  25
    3.1.3 主要仪器、耗材  25-26
  3.2 方法  26-31
    3.2.1 hGC-MSCs和hGCN-MSCs的分离扩增  26
    3.2.2 流式细胞仪检测hGC-MSCs和hGCN-MSCs表面标记  26
    3.2.3 生长曲线  26
    3.2.4 细胞周期  26-27
    3.2.5 RNA提取以及逆转录  27
    3.2.6 PCR扩增  27-28
    3.2.7 T-A克隆  28-29
    3.2.8 荧光定量PCR  29
    3.2.9 裸鼠致瘤实验  29
    3.2.10 成骨诱导培养  29
    3.2.11 成脂诱导培养  29-30
    3.2.12 细胞爬片制作及免疫组织化学染色  30
    3.2.13 核型分析  30
    3.2.14 Transwell迁移实验  30-31
    3.2.15 统计分析  31
  3.3 结果  31-44
    3.3.1 hGC-MSCs、hGCN-MSCs培养与生长特性  31-32
    3.3.2 生长曲线  32-33
    3.3.3 细胞周期  33
    3.3.4 表面标志  33-34
    3.3.5 核型分析  34-35
    3.3.6 裸鼠致瘤模型  35
    3.3.7 RNA提取结果  35-36
    3.3.8 基因表达  36-38
    3.3.9 免疫组化分析  38-39
    3.3.10 诱导分化为成骨、成脂细胞  39-40
    3.3.11 Transwell实验  40-41
    3.3.12 Real-time PCR检测β-actin与Bmi-1标准品的制备  41-42
    3.3.13 Real-time PCR检测Bmi-1在hGC-MSCs、hGCN-MSCs中的表达  42-44
  3.4 讨论  44-47
结论与展望  47-48
致谢  48-49
参考文献  49-55
攻读硕士学位期间获奖及发表的学术论文  55-56

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 胃肿瘤
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