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慢病毒载体介导的TNF-α基因在脐血间充质干细胞中的表达的实验研究

作　者: 马贵亮
导　师: 毛伟征
学　校: 青岛大学
专　业: 外科学
关键词: 慢病毒载体 TNF-α基因 脐血间质干细胞 转基因技术
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 36次
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内容摘要


[目的]：构建带有人TNF-a基因的慢病毒载体,并观察该基因在人脐血间质干细胞中的表达。[方法]：通过逆转录聚合酶链反应从PCD DNA-TNF-a质粒中获得人TNF-α基因,利用Infusion技术重组构建慢病毒载体穿梭质粒pGC-FU-TNF-α,在脂质体lipofectamine 2000介导下与结构质粒pHelperl.0和包膜质粒pHelper2.0共转染293T细胞包装生产慢病毒。将人脐血间质干细胞分为实验组(pGC-FU-TNF-a),空载体对照组(pGC-FU-EGFP)及空白组(UCBMSCs),分别用重组慢病毒,空载慢病毒,PBS感染后,采用RT-PCR以及Elisa检测TNF-a表达情况。[结果]：(1)所获TNF-a基因测序证明与Gene Bank中序列一致：(2)重组慢病毒载体质粒pGC-FU-TNF-a经鉴定正确；(3)三质粒共转染293T细胞成功,收集、浓缩病毒后测定其滴度为2×107TU/L。(4)重组慢病毒感染人脐血间质干细胞后行RT-PCR检测三组细胞电泳结果显示均有TNF-a mRNA表达,其中实验组光密度值(2.71±1.57),与空载对照组(4.63±1.32),空白组(6.03±0.88)比较差异有统计学意义(F=11.677,P<0.01)；ELISA检测三组细胞TNF-a浓度结果显示实验组(1.32±0.23ug/ml)与空载对照组(0.70±0.25ug/ml),空白组(0.76±0.11ng/ml)比较差异有统计学意义(F=21.321,P<0.01)。[结论]：(1)构建带有TNF-a基因的慢病毒载体,包装生产高滴度重组慢病毒；(2)重组慢病毒成功感染脐血间质干细胞并实现TNF-a在脐血间质干细胞中的表达；(3)转基因TNF-a脐血间充质干细胞的构建为治疗胃癌的应用奠定理论基础。

全文目录


摘要  2-4
Abstract  4-9
前言  9-11
第一章 实验材料  11-13
  1.1 药物及试剂  11-12
  1.2 主要仪器  12
  1.3 实验细胞和菌株  12-13
第二章 实验方法  13-30
  2.1 含有TNF-α基因的pGC-FU-TNF-α质粒的构建  13-19
    2.1.1 逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)  13-15
    2.1.2 目的基因TNF-α PCR产物及慢病毒载体的DNA质粒载体的AgeⅠ酶切  15
    2.1.3 TNF-αcDNA与质粒载体pGC-FU-EGFP的连接  15-16
    2.1.4 连接产物导入大肠杆菌  16-17
    2.1.5 重组质粒鉴定  17-18
    2.1.6 重组质粒抽提  18-19
  2.2 慢病毒包装以及滴度检测  19-26
    2.2.1 病毒包装细胞293T的培养  19-20
    2.2.2 细胞转染  20
    2.2.3 重组慢病毒的收获及浓缩  20-21
    2.2.4 Westernblot检测目的基因TNF-α的表达  21-24
    2.2.5 慢病毒滴度测定  24-26
  2.3 慢病毒感染脐血间质干细胞  26-27
    2.3.1 脐血间质干细胞培养  26
    2.3.2 慢病毒感染脐血间质干细胞预实验  26-27
    2.3.3 慢病毒感染脐血间质干细胞  27
  2.4 检测脐血间质干细胞中TNF-α的表达情况  27-29
    2.4.1 Elisa检测细胞上清中TNF-α含量  27-28
    2.4.2 RT-PCR检测脐血间质干细胞TNF-α mRNA的表达情况  28-29
  2.5 统计学方法  29-30
第三章 实验结果  30-33
  3.1 慢病毒载体表达质粒pGC-FU-TNF-α构建  30
    3.1.1 目的基因TNF-α获得  30
    3.1.2 成纤维细胞的形态学观察  30
  3.2 三质粒共转染293T细胞EGFP的表达  30
  3.3 westernblot检测慢病毒转染293T细胞的TNF-α含量  30
  3.4 重组慢病毒的包装和病毒滴度  30-31
  3.5 慢病毒感染人脐血间质干细胞表达情况  31
  3.6 Elisa检测上清液中TNF-α含量  31-32
  3.7 RT-PCR检测脐血间质干细胞中TNF-α mRNA表达  32-33
讨论  33-35
结论  35-36
参考文献  36-38
附图  38-44
综述  44-58
  参考文献  55-58
攻读学位期间的研究成果  58-59
中英文对照  59-60
致谢  60-62

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体形态学 > 人体组织学
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