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骨髓间质干细胞突变肿瘤干细胞的分离、鉴定和生物学特性

作　者: 徐学静
导　师: 许文荣
学　校: 江苏大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: 间质干细胞肿瘤干细胞 CD133 DAPK基因 FHIT基因
分类号: R73-3
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

目的建立人胚胎骨髓间质干细胞（FMSC）突变肿瘤细胞系（F6）中肿瘤干细胞分离、鉴定和培养的方法;初步探讨F6肿瘤干细胞与非肿瘤干细胞、F6与FMSC之间的生物学特性差异,通过人全基因组芯片筛选差异表达基因与治疗的靶标;研究F6和FMSC细胞中死亡相关蛋白激酶基因（DAPK）和脆性组氨酸三联基因（FHIT）启动子甲基化状态,去甲基化药物5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）处理后对F6和FMSC细胞生物学特性的影响。方法F6细胞BALB/c裸鼠皮下致瘤后,取瘤组织过200目铜网得到单细胞悬液,使用流式细胞仪分选出F6-CD133+细胞和F6-CD133-细胞并对其纯度进行测定。分选得到的F6-CD133+细胞和F6-CD133-细胞进行BALB/c裸鼠皮下致瘤实验并观察比较瘤体积的大小。分选后的细胞在完全培养基（含10%FBS的DMEM）、低血清培养基（含2%FBS的DMEM）和添加LIF、EGF、bFGF的无血清培养基（SFM）中培养,通过检测CD133表面标记的变化比较F6-CD133+细胞和F6-CD133-细胞的分化能力。生长曲线、软琼脂克隆形成试验以及Western blot检测AKT、ERK蛋白表达,比较F6-CD133+细胞和F6-CD133-细胞的增殖能力。顺铂（DDP）及5-氟尿嘧啶（5-FU）两种化疗药物处理F6-CD133+和F6-CD133-细胞后,MTT法检测细胞存活率,比较两种细胞的耐药性。使用晶芯（?）人类全基因组寡核苷酸微阵列芯片比较F6-CD133+/F6-CD133-细胞、F6/FMSC细胞之间表达差异的基因。荧光实时定量RT-PCR验证差异表达基因。甲基化特异性PCR（MSP）检测DAPK、FHIT基因启动子在F6和FMSC细胞中甲基化的状态,PCR产物经测序验证。使用5-Aza-CdR处理F6和FMSC细胞后,检测DAPK、FHIT基因mRNA表达改变,流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡。结果流式分析F6细胞中含有21.1%F6-CD133+细胞,流式分选F6-CD133+细胞纯度为86%,F6-CD133-细胞纯度达到97.9%。F6-CD133+细胞具有较强的BALB/c裸鼠致瘤能力,仅1×10³个F6-CD133+细胞即可致瘤,而F6-CD133-细胞致瘤能力较弱。体外含10%FBS的DMEM培养基中培养一个月后F6-CD133+细胞CD133表面标记由89%下降到7.44%,而在含2%FBS的低血清培养基中F6-CD133+细胞CD133表面标记维持在68.87%,F6-CD133-细胞CD133阳性率一直保持2%左右。F6-CD133+细胞生长速度比F6-CD133-细胞快,软琼脂克隆形成试验结果证实F6-CD133+细胞具有较高的克隆形成率,Western blot检测发现AKT、ERK蛋白在F6-CD133+细胞表达水平高。化疗药物敏感试验结果显示,DDP比5-FU更能有效杀伤F6-CD133+细胞。基因芯片结果显示,F6/FMSC细胞之间有4715个差异表达基因,其中上调基因2911个,下调基因1804个;F6-CD133+/F6-CD133-细胞之间有673个差异表达基因,其中上调基因520个,下调基因153个。MSP检测发现F6细胞DAPK、FHIT基因启动子发生甲基化,经5-Aza-CdR处理后FHIT基因被激活表达,流式分析细胞周期结果显示,药物作用后F6细胞先阻滞在G₂期,随着作用时间延长可以观察到细胞发生凋亡,hoechest 33342染色荧光显微镜下发现凋亡细胞,但是相同剂量的5-Aza-CdR作用于FMSC,FMSC细胞周期没有发生改变。结论采用流式细胞分选术成功分离了FMSC突变肿瘤细胞系F6中F6-CD133+细胞,体外增殖分化试验和裸鼠体内致瘤试验证实了该细胞具有肿瘤干细胞的特性,即较强的增殖和致瘤能力。含2%FBS的低血清培养条件对保持F6-CD133+细胞具有明显影响。基因芯片结果初步显示它们之间存在着差异表达基因,差异表达基因与MAKP、Wnt、Cell cycle等信号通路有关。化疗药物耐药试验为F6肿瘤的治疗提供指导。FHIT基因DNA启动子甲基化可能在FMSC突变为F6肿瘤细胞中发挥重要作用,为MSC突变致瘤提供了一个潜在的治疗靶标。

全文目录

摘要  6-9
ABSTRACT  9-16
第一章绪论  16-26
  1.1 间质干细胞  16-18
    1.1.1 间质干细胞生物学特性及应用  16-17
    1.1.2 间质干细胞临床应用安全性问题  17-18
  1.2 肿瘤干细胞  18-22
    1.2.1 肿瘤发生与肿瘤干细胞理论  18
    1.2.2 肿瘤干细胞生物学特性  18-19
    1.2.3 肿瘤干细胞的分离  19-20
    1.2.4 肿瘤干细胞的鉴定  20
    1.2.5 肿瘤干细胞研究进展  20-21
    1.2.6 间质干细胞突变致瘤肿瘤干细胞研究及意义  21-22
  1.3 DNA甲基化  22-26
    1.3.1 DNA甲基化与肿瘤发生  22-23
    1.3.2 DAPK基因甲基化与肿瘤发生  23
    1.3.3 FHIT基因甲基化与肿瘤发生  23-24
    1.3.4 DNA去甲基化与肿瘤治疗  24
    1.3.5 存在问题与展望  24-26
第二章研究目的、方法、实验设计方案和意义  26-30
  2.1 研究目的  26
  2.2 研究方法  26-27
  2.3 实验设计方案  27-29
  2.4 研究意义  29-30
第三章 F6肿瘤干细胞分离鉴定及生物学特性  30-50
  3.1 试剂与仪器  30-32
    3.1.1 主要试剂  30-31
    3.1.2 主要仪器、耗材  31-32
  3.2 方法  32-36
    3.2.1 细胞培养  32
    3.2.2 流式细胞分选及表面标记检测  32
    3.2.3 细胞周期  32
    3.2.4 RNA提取以及逆转录  32-33
    3.2.5 PCR扩增  33
    3.2.6 T-A克隆  33
    3.2.7 荧光定量PCR  33-34
    3.2.8 裸鼠致瘤实验  34-35
    3.2.9 生长曲线  35
    3.2.10 软琼脂克隆形成  35
    3.2.11 化疗药物敏感试验  35
    3.2.12 Western blot  35
    3.2.13 基因芯片  35-36
    3.2.14 统计分析  36
  3.3 结果  36-47
    3.3.1 F6细胞分选及CD133表达检测  36
    3.3.2 细胞培养体系优化  36-37
    3.3.3 细胞周期  37
    3.3.4 生长曲线  37
    3.3.5 克隆形成能力分析  37
    3.3.6 Western blot检测AKT、ERK基因蛋白水平改变  37
    3.3.7 裸鼠致瘤模型  37
    3.3.8 化疗药物敏感试验  37-38
    3.3.9 基因芯片  38
    3.3.10 荧光定量PCR验证基因芯片结果  38-47
  3.4 讨论  47-50
第四章 F6细胞DAPK FHIT启动子甲基化的研究  50-62
  4.1 试剂与仪器  50-51
    4.1.1 主要试剂  50
    4.1.2 主要仪器、耗材  50-51
  4.2 方法  51-53
    4.2.1 DNA制备与修饰  51
    4.2.2 DAPK基因甲基化检测  51-52
    4.2.3 FHIT基因甲基化检测  52
    4.2.4 PCR产物回收、纯化与测序  52-53
    4.2.5 5-Aza-CdR去甲基化  53
  4.3 结果  53-60
    4.3.1 RT-PCR检测DAPK、FHIT基因表达  53
    4.3.2 MSP检测DAPK基因甲基化及测序结果  53
    4.3.3 MSP检测FHIT基因甲基化及测序结果  53
    4.3.4 RT-PCR检测FHIT基因mRNA表达水平的变化  53-54
    4.3.5 细胞形态学及细胞周期  54
    4.3.6 细胞凋亡检测  54-60
  4.4 讨论  60-62
结论及展望  62-64
致谢  64-66
参考文献  66-74
攻读硕士学位期间获奖及发表的学术论文  74-76

骨髓间质干细胞突变肿瘤干细胞的分离、鉴定和生物学特性

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