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两种双生病毒伴随的卫星启动子的鉴定

作　者: 张馨月
导　师: 周雪平；钱亚娟
学　校: 浙江大学
专　业: 植物病理
关键词: 赛葵黄脉病毒 中国番茄黄化曲叶病毒 βC1基因 启动子
分类号: Q939.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 38次
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内容摘要


DNAβ是与某些单组份双生病毒相伴随的卫星分子,能在自然寄主上引起典型侵染症状。迄今发现的所有DNAβ分子在互补链上都编码一个大小和位置保守的βCl基因,它是一种致病决定因子。关于βCl基因启动子的研究,目前的研究报道还很少。赛葵黄脉病毒(MYVV)和中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)均是本实验室鉴定的伴随有DNAβ分子的单组份双生病毒,为了进一步明确它们伴随的卫星DNA启动子对病毒症状的调节作用,本论文分离并鉴定了TYLCCNV Y25分离物(TYLCCNV-Y25)和MYVV Y47分离物(MYVV-Y47)DNAβ分子上βCl基因的启动子。利用根癌土壤杆菌介导的方法鉴定了MYVV-Y47 DNAβ分子上βCl基因的启动子。用GUS和GFP基因做为报告基因,通过组织化学法和荧光光度法测定启动子的活性。瞬时表达结果表明,MYVV-Y47βCl基因翻译起始位点上游的991核苷酸(nt)片段具有启动子活性;5’端缺失的片段以及A-rich区缺失的片段均保留了启动子活性;与花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子相比,991 nt片段的启动子活性最高,是35S启动子活性的28.05%。对启动子进行遗传转化后进行组织化学检测表明,翻译起始位点上游的991 nt和214 nt片段均能够驱动GUS基因在转基因普通烟植株中组成型表达。利用根癌土壤杆菌介导的方法鉴定了TYLCCNV-Y25 DNAβ分子上βCl基因的启动子。用GUS基因做为报告基因,通过组织化学法和荧光光度法测定启动子的活性。瞬时表达结果表明,TYLCCNV-Y25βCl基因翻译起始位点上游的982 nt片段具有启动子活性,其活性是CaMV 35S启动子活性的46.23%。5’端以及A-rich区都缺失的206 nt片段保留有启动子活性并且其活性与982 nt片段的启动子活性没有显著性差异。

全文目录


致谢  5-6
摘要  6-7
Abstract  7-8
目录  8-10
1.文献综述  10-31
  1.1 高等植物启动子的研究进展  10-19
    1.1.1 启动子的基本结构  10-12
    1.1.2 植物启动子的分类  12-19
  1.2 启动子的研究方法  19-24
    1.2.1 启动子的分离克隆和活性检测  19-22
    1.2.2 启动子数据库资源和电子预测  22-24
  1.3 双生病毒启动子研究进展  24-31
    1.3.1 双生病毒的分类及基因组结构  24-27
    1.3.2 双生病毒启动子调控  27-31
2.赛葵黄脉病毒Y47分离物伴随的卫星启动子活性检测  31-60
  2.1 材料与方法  31-46
    2.1.1 病毒毒源和供试植物  31
    2.1.2 菌株和质粒  31-32
    2.1.3 试剂与仪器  32
    2.1.4 PCR技术  32-33
    2.1.5 DNA克隆技术  33-35
    2.1.6 电击法  35-36
    2.1.7 植物总DNA的制备  36
    2.1.8 βC1 ORF启动子表达载体的构建  36-39
    2.1.9 启动子的序列分析  39-40
    2.1.10 瞬时表达  40
    2.1.11 烟草的转化  40-41
    2.1.12 转基因植物总DNA提取(CTAB法)  41-42
    2.1.13 转基因烟草的PCR鉴定  42
    2.1.14 转基因植物总RNA提取  42-43
    2.1.15 Real time PCR检测植物基因的表达量  43-44
    2.1.16 GUS活性的组织化学染色  44-45
    2.1.17 GUS荧光活性分析  45-46
  2.2 实验结果  46-58
    2.2.1 βC1 ORF全长启动子的序列分析  46
    2.2.2 βC1 ORF启动子表达载体的构建  46-49
    2.2.3 瞬时表达中GUS荧光活性分析  49-50
    2.2.4 瞬时表达中GFP荧光活性分析  50-51
    2.2.5 转基因烟草的获得和分子鉴定  51-53
    2.2.6 转基因普通烟中的GUS荧光活性分析和Realtime PCR分析  53-55
    2.2.7 转基因普通烟中GUS活性的组织化学分析  55-58
  2.3 讨论  58-60
3.中国番茄黄化曲叶病毒Y25分离物伴随的卫星启动子活性检测  60-67
  3.1 材料和方法  60-62
    3.1.1 病毒毒源和供试植物  60
    3.1.2 菌株和质粒  60
    3.1.3 Y25 βC1 ORF启动子表达载体的构建  60-62
    3.1.4 瞬时表达和GUS活性检测、分析  62
  3.2 实验结果  62-66
    3.2.1 TYLCCNV-Y25β启动子的序列分析  62-63
    3.2.2 TYLCCNV-Y25β启动子的克隆与表达载体的构建  63-65
    3.2.3 瞬时表达中GUS荧光活性分析  65-66
  3.3 讨论  66-67
4.全文小结  67-68
5.参考文献  68-78
6.附录  78-82
  附录A 常用生化及分子生物学试剂与仪器  78-79
  附录B 常用缓冲液及培养基配方  79-82

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学 > 微生物分类学（系统微生物学） > 病毒（滤过性病毒）
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