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家蚕丝腺生物反应器表达hIGF-Ⅰ转基因分泌表达载体的构建及其应用研究

作　者: 潘兴亮
导　师: 贡成良
学　校: 苏州大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 家蚕 BmN细胞转基因 piggyBac转座子转基因分泌表达载体 hIGF- I
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

家蚕(Bombyx mori),又名桑蚕,属鳞翅目家蚕蛾科。其幼虫丝腺具有强大的合成和分泌蛋白质的能力,利用家蚕丝腺生物反应器安全、高效地生产药用蛋白有很好的实用前景。近几年以转基因家蚕表达外源蛋白的技术体系正被逐步建立。人胰岛样生长因子(hIGF- I)具有多种生物学功能,本研究期望通过家蚕转基因实现hIGF- I在丝腺中分泌表达,开辟hIGF- I表达新途径,提高家蚕的利用价值。我们克隆了丝素蛋白重链基因(fibroin heavy chain, fib-H)启动子及其下游信号肽序列即fib-HS;构建了fib-HS控制红色荧光蛋白(DsRed)报告基因的瞬时分泌表达载体pSK- FibHS- DsRed -PolyA;转染细胞实验显示,该载体能在家蚕BmN细胞中瞬时表达DsRed;家蚕注射该载体后,可在丝腺腔中检测到红色荧光,表明瞬时表达的DsRed分泌到丝腺腔,推测所克隆的序列具有信号肽的功能。以fib-HS控制hIGF- I、家蚕杆状病毒ie-1启动子驱动新霉素抗性基因(neor)构建了基于piggyBac转座子的转基因分泌表达载体pigA3GFP-FibHS-IGF-PolyA-IE-Neo,在辅助质粒的存在下,pigA3GFP-FibHS-IGF-PolyA-IE-Neo转染家蚕BmN细胞,通过G418(终浓度800μg/mL)的压力筛选,获得了稳定表达hIGF-I的转化细胞系,ELISA检测结果显示,hIGF- I在转化细胞中的表达水平约为29.5ng/105cells。采用精子介导法及基因枪法将pigA3GFP-FibHS-IGF-PolyA-IE-Neo转基因分泌表达载体导入家蚕,通过G418和荧光报告基因(GFP)的双重筛选,在G0代获得3头具有明显绿色荧光的家蚕;用gfp基因的特异性引物可从呈绿色荧光的家蚕基因组中特异性地扩增出gfp基因,表明所获得的荧光蚕为转基因家蚕;反向PCR分析插入位点结果显示,未发现piggyBac转座子特异性插入位点;ELISA检测结果显示,在G0代转基因家蚕的蚕茧中hIGF- I的表达量约756ng/g

全文目录

中文摘要  6-7
Abstract  7-9
第一章家蚕生物反应器的相关研究进展  9-20
  1 转基因动物研究概况  9-10
  2 动物生物反应器研究进展  10
  3 转基因昆虫的研究概况  10-11
  4 转基因家蚕研究概况  11-15
    4.1 转基因家蚕研究  11-13
    4.2 家蚕生物反应器研究概况  13-15
  参考文献  15-20
第二章胰岛素样生长因子的研究进展  20-28
  1 胰岛素样生长因子的分子结构和作用机理  20-22
    1.1 分子结构  21
    1.2 作用机理  21-22
  2 生物学功能  22-24
    2.1 IGFs 促生长发育的作用  22-23
    2.2 IGFs 的物质代谢作用  23
    2.3 IGFs 的免疫调节作用  23-24
  3 IGF-I 在动物生产中的研究应用  24-25
  4 研究展望  25
  参考文献  25-28
第三章研究目的与内容  28-31
  1 研究的目的和意义  28-29
  2 研究技术路线  29
  3 研究内容  29-31
第四章材料与方法  31-37
  1 一般材料  31-33
    1.1 载体、菌种、细胞和家蚕  31
    1.2 工具酶及其试剂  31
    1.3 培养基  31-32
    1.4 缓冲液和常用溶液  32-33
  2 常用仪器  33-34
  3 常用实验方法  34-37
    3.1 PCR 扩增目的片段  34
    3.2 目的片段的分离和回收  34
    3.3 DNA 的酶切反应体系  34
    3.4 DNA 的连接反应体系  34-35
    3.5 质粒DNA 的制备  35
    3.6 感受态细胞的制备  35
    3.7 连接产物的转化  35
    3.8 重组质粒的筛选  35-36
    3.9 限制性内切酶反应  36
    3.10 细胞的传代  36-37
第五章家蚕丝素重链启动子驱动DsRed 的瞬时分泌表达  37-47
  1 材料与方法  38-40
    1.1 材料  38
    1.2 方法  38-40
  2 结果与分析  40-43
    2.1 pSK-FibHS-DsRed-PolyA 的构建与鉴定  40-41
    2.2 带有信号肽序列的fib-H 启动子在BmN 细胞中的活性检测  41
    2.3 带有信号肽序列的Fib-H 启动子在丝腺组织中的活性检测  41-43
  3 讨论  43-44
  参考文献  44-47
第六章 pigA3-GFP -Neo -En-[FibHS- IGF- polyA]转基因分泌表达载体的构建  47-53
  1 材料与方法  48-50
    1.1 材料与试剂  48
    1.2 方法  48-50
  2 结果与分析  50-51
    2.1 转基因分泌表达载体的酶切鉴定  50-51
  3 讨论  51-52
  参考文献  52-53
第七章 piggyBac 转座子介导的家蚕细胞转基因研究  53-61
  1 引言  53-54
  2 材料与方法  54-56
    2.1 实验材料  54
    2.2 方法  54-56
  3 结果与分析  56-59
    3.1 转化细胞的筛选  56
    3.2 转化细胞的PCR 鉴定  56-57
    3.3 转化细胞的SDS-PAGE 分析  57-58
    3.4 ELISA 检测转化细胞的hIGF-I 的表达  58-59
  4 讨论  59-60
  参考文献  60-61
第八章 pigA3-GFP-Neo-En-[FibHS-IGF-polyA]家蚕转基因研究  61-73
  1 引言  61-62
  2 材料与方法  62-65
    2.1 实验材料  62-63
    2.2 实验方法  63-65
  3 结果与分析  65-70
    3.1 G0 转基因家蚕的获得  65-66
    3.2 转基因家蚕的继代  66-67
    3.3 转基因家蚕的分子检测  67-69
    3.4 转基因家蚕蚕茧中目的蛋白IGF-I 的表达分析  69-70
  4 讨论  70-71
  参考文献  71-73
结论  73-74
硕士期间科研情况  74-75
中英文缩略表  75-76
致谢  76

家蚕丝腺生物反应器表达hIGF-Ⅰ转基因分泌表达载体的构建及其应用研究

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