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转座子介导的多角体基因表达及提高重组杆状病毒经口感染效率

作　者: 陈璐
导　师: 王文兵
学　校: 江苏大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 杆状病毒多角体基因转基因家蚕感染性包装
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

昆虫杆状病毒表达系统(BEVS)作为一种优秀的真核细胞表达系统,具备插入大片段外源基因的能力。同时昆虫杆状病毒表达系统所产生的蛋白与人体蛋白的表达修饰(磷酸化),生物活性及蛋白稳定性都十分类似。正是由于以上的这些优点,昆虫杆状病毒表达系统已经广泛应用到了科学研究和生产实践中。然而,由于绝大多数重组杆状病毒因缺乏多角体基因(poly),导致病毒无法形成病毒包涵体,从而使重组杆状病毒只能通过穿刺注射的方式感染昆虫幼虫,造成病毒接种过程繁琐,费时费力,且容易使昆虫幼虫因感染细菌病死亡,这些都给重组杆状病毒的进一步应用带来了极大的阻碍。为了解决这一难题,我们构建了携带多角体基因的转座子载体,转染家蚕细胞后获得稳定的转基因细胞;以转基因细胞来包装重组杆状病毒的方法,来提高重组杆状病毒经口感染家蚕幼虫的能力。这也为方便杆状病毒的应用提供了一个新的思路。具体的实验工作如下:按照NCBI上的基因数据库设计poly特异引物,通过PCR扩增方法获得该基因片段,之后将poly片段连接到转座子载体pigA3GFP上;同时按照基因数据库设计iel启动子及poly启动子特异引物,经PCR扩增后将获得的基因片段分别插入到之前构建好的带有poly基因的转座载体上,分别获得转座载体pigA3GFP-ie和pigA3GFP-poly。将构建好的转座载体质粒与辅助质粒通过脂质体转染法共转染家蚕细胞,获得带有绿色荧光的家蚕细胞。经多轮的细胞筛选,我们获得了稳定的带有poly基因的转基因家蚕细胞。之后进行了多角体基因的RT-PCR验证,证明了poly基因在转基因细胞中得到了表达。再用BmPAK6和BmGFP这两种病毒作为测试病毒,来感染之前获得的带有poly基因的转基因细胞,以检测该转基因细胞能否包装重组杆状病毒。实验结果显示带有poly,基因的转基因细胞能够对BmPAK6和BmGFP这两种病毒进行包装,并在感染病毒72小时后的细胞中出现病毒包涵体颗粒。将获得的病毒颗粒通过喷洒桑叶的方式喂食5龄家蚕幼虫,观察其感染效果。结果显示通过转基因细胞包装所形成的重组病毒包涵体,其经口感染家蚕幼虫的感染力远远高于未包装的重组杆状病毒。同时结果也显示包装后的重组病毒经口感染家蚕幼虫的毒力相对于野生型病毒BmNPV,约为后者的40%左右。这些结果表明poly基因在转基因家蚕细胞中的表达产物能够包装重组杆状病毒,同时也能提高这些病毒经口感染家蚕幼虫的能力。这些实验的研究结果,将为扩大杆状病毒的应用提供新的方法和思路。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-12
缩写与符号  12-13
第1章绪论  13-22
  1.1 昆虫杆状病毒表达系统  13-18
    1.1.1 杆状病毒的生物学特性  13
    1.1.2 杆状病毒多角体蛋白概述  13-14
    1.1.3 杆状病毒表达系统(BEVS)概述  14-17
    1.1.4 BEVS系统的应用前景  17-18
  1.2 昆虫转基因系统  18-21
    1.2.1 转基因系统的概述  18
    1.2.2 转座子(Transposon)概述  18-19
    1.2.3 转基因家蚕的相关研究  19-20
    1.2.4 转基因家蚕的应用及展望  20-21
  1.3 本课题研究的目的、意义和内容  21-22
    1.3.1 本课题研究的目的  21
    1.3.2 本课题研究的意义  21
    1.3.3 本课题研究的主要内容  21-22
第2章家蚕核型多角体病毒poly基因的克隆及序列分析  22-32
  2.1 材料和方法  22-27
  2.2 结果与分析  27-30
    2.2.1 poly基因片段PCR分析  27-28
    2.2.2 重组质粒酶切鉴定  28
    2.2.3 poly基因测序  28
    2.2.4 poly基因序列和蛋白序列比较  28-30
  2.3 本章小结  30-32
第3章建立携带有poly基因的家蚕细胞及该细胞对重组杆状病毒的包装研究  32-51
  3.1 实验材料  32-34
  3.2 实验方法  34-42
  3.3 结果与分析  42-49
    3.3.1 PCR分析  42-43
    3.3.2 转基因载体的构建  43-44
    3.3.3 转基因载体的酶切鉴定  44-46
    3.3.4 转基因细胞的筛选  46-47
    3.3.5 转基因细胞中poly基因的表达  47-48
    3.3.6 转基因细胞对重组杆状病毒的包装  48-49
  3.4 本章小结  49-51
第4章经转基因细胞包装后的重组杆状病毒对家蚕幼虫的感染性分析  51-57
  4.1 实验材料及方法  51-53
    4.1.1 实验材料  51
    4.1.2 实验方法  51-53
  4.2 实验结果  53-55
    4.2.1 包装后重组杆状病毒的感染性测定  53-55
  4.3 本章小结  55-57
第5章结论及工作展望  57-58
  5.1 主要结论  57
  5.2 工作展望  57-58
致谢  58-59
参考文献  59-64
在学期间发表论文  64

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