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增量表达抗病毒蛋白Bmlipase-1的家蚕转基因系统的建立

作　者: 陈杰
导　师: 赵萍；夏庆友
学　校: 西南大学
专　业: 特种经济动物饲养
关键词: 转基因系统胰脂肪酶非转基因家蚕转基因载体启动子攻毒病毒抗性转基因技术抗病毒蛋白
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 24次
引　用: 2次
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内容摘要

脂肪酶(Lipase),国际生化联合会的命名分类编号为EC.3.1.1.3,中文系统名称为三脂酰甘油酰基水解酶。脂肪酶广泛存在于动植物和微生物中,属于α/β水解酶家族。脂肪酶在生物体中主要作用是水解三酰基甘油、二酰基甘油、单酰基甘油、甘油以及游离氨基酸的酯键等。家蚕脂肪酶1(BmLipase-1)是已被证实的对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)具有强烈抵抗作用的内源蛋白,而且其表达并不会因病毒攻击而应激上调。本论文本研究旨在探讨内源增量表达病毒抗性蛋白Bmlipase-1对病毒抗性的影响,以期为家蚕抗病育种提供新的思路。基于家蚕基因组精细图和全基因组序列,系统鉴定了家蚕脂肪酶基因,并对相关基因的结构及表达特征进行了分析。此外,通过基于piggyBac转座子的转基因技术,构建了肌动蛋白A4启动子和病毒基因IE1启动子启动的BmLipase-1的表达载体,显微注射获得转基因个体,并对转基因株系进行了病毒抗性检测。本文获得的主要研究结果如下:1.家蚕脂肪酶的生物信息学分析基于序列的相似性及功能域保守性,在家蚕基因组数据库中检索可能的家蚕脂肪酶基因。成功地在家蚕中鉴定出了lipase基因家族的30个成员,染色体位置分析表明整个家族的成员比较分散,染色体定位分析显示Bmlipase-1位于第5号染色体上。结合进化树分析Bmliase2基因可能与Bmlipase1互为重复基因。芯片数据显示家蚕的lipase主要分为三种,一种在脂肪体和生殖腺中表达,一种在中肠和血液中表达,一种在丝腺中表达。具有病毒抗性的Bmlipase1与果蝇lipase和人的lipase蛋白的同源性分别为56%和21%,组织芯片数据分析显示其在5龄3天的中肠和血液中表达,以中肠的表达量最高,发育时期芯片数据显示其在上簇以后不表达,同时BmNPV诱导芯片数据显示其表达量并不受病毒的诱导而发生变化。2.增量表达Bmlipase-1的转基因表达载体的构建以家蚕5龄3天中肠cDNA中为模板,克隆了Bmlipase-1全KCDS,通过pMD19T-simple、L4440、以及pSLfa1180fa和piggyBac[3×p3 EGFP afm]等多个基础载体,成功构建了增量表达Bmlipase-1的转基因表达载体pBac[IE1Pqipase-sv40-3×P3-EGFPafm]和PBac[A4P-lipase-sv40-3×P3-EGFPafm]。转基因载体通过酶切进行检测,并经测序确认正确。3.转基因阳性个体的获得及分子检测利用构建的转基因载体,选择滞育性蚕品种大造作为受体材料,进行转基因注射,筛选含有标记基因EGFP的阳性个体,并进行多代培养,成功获得以IE1启动子启动Bmlipase-1表达的转基因系IEI-Bmlipase-1和以A4为启动子启动Bmlipasel表达的转基因系A4-Bmlipase-1。通过southern杂交、RT-PCR和定量PCR等技术对转基因阳性株系的转基因拷贝数和mRNA表达水平进行了检测。结果显示A4-Bmlipasel有3个拷贝,IE1-Bmlipasel含有1个拷贝。而在转录水平,转基因系统Bmlipase-1的mRNA的表达量明显高于非转基因大造品种,而且A4-Bmlipasel转基因系统的Bmlipase-1的mRNA的表达量高于IEI-Bmlipase1转基因系统。研究结果显示,IEI-Bmlipase1转基因系在3龄期前Bmlipase-1的mRNA表达量与非转基因系统的差距不大,在4龄起之后的表达量明显提高。4.转基因阳性株系的病毒抗性检测为了验证增量表达的BmNPV对蚕体病毒抗性的影响,我们对获得的IEI-Bmlipase1转基因系进行了攻毒检测。经ID50测试后设立2个病毒攻击浓度2.66×10~4和3.46×10~4。对攻毒结果进行统计学分析,表明Bmlipase-1在攻毒后的第8天,浓度为2.66×10~4的转基因组1相较同浓度对照组1的抗病毒效果显著,死亡率降低20%左右,而浓度为3.46×10~4转基因组2的也有一定抗病效果,死亡率降低了15%左右。攻毒后5至8天的曲线图上显示转基因组与同浓度对照组相比,死亡时间延后。通过对攻毒后24小时以内的材料进行定量PCR分析,转基因组的lipase-1mRNA水平比对照组高,结合攻毒数据推测可能是lipase的增量表达产生了比较明显的抗病效果,从而在总体水平上使得转基因品系的死亡速度延缓。而因为继发感染等各种原因,导致后期蚕只大量死亡以至于死亡率变得非常接近。综上所述,本论文基于家蚕全基因组精细图谱和全基因组表达芯片数据,系统鉴定和分析了家蚕的脂肪酶基因。成功构建了增量表达病毒抗性蛋白Bmlipase-1的piggBac转基因载体,经显微注射成功获得ie1启动子启动Bmlipase-1表达的ie1+lipase-1转基因系的A4为启动子启动Bmlipase-1表达的的A4+lipase-1转基因系,基因表达量分析表明,转基因系统的病毒抗性蛋白Bmlipase-1的表达量明显高于非转基因系统。对转基因系统进行病毒攻击测试,结果显示,较之于非转基因系统,转基因系统对BmNPV的抗性均呈现不同程度的提高。相关研究结果表明,基于转基因技术,内源增量表达病毒抗性蛋白也是增强宿主抗性的一种手段,为抗病品种选育提供了一定参考。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-14
第一章文献综述  14-24
  1.1 脂肪酶  14-19
    1.1.1 α/β水解酶家族  14
    1.1.2 脂肪酶基因家族的起源与分类  14-15
    1.1.3 脂肪酶的晶体结构  15-16
    1.1.4 脂肪酶的功能  16-17
    1.1.5 脂肪酶基因家族的活性区鉴定过程  17
    1.1.6 脂肪酶在物种中的研究  17-19
    1.1.7 脂肪酶的应用  19
  1.2 核型多角体病毒(NPV)  19-22
    1.2.1 NPV的生活史与感染方式  19-20
    1.2.2 NPV与宿主进化抗争  20-21
    1.2.3 家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的感染方式及危害  21-22
  1.3 家蚕脂肪酶1(Bmlipase-1)的抗BmNPV研究进展  22-24
第二章引言  24-28
  2.1 研究意义与研究背景  24-25
  2.2 主要研究内容  25
  2.3 技术路线  25-28
第三章家蚕lipase家族成员的鉴定及表达特征分析  28-36
  3.1 材料与方法  28-29
    3.1.1 数据来源  28
    3.1.2 本章生物信息学分析中主要使用的软件以及涉及的网站  28
    3.1.3 家蚕lipase家族的鉴定  28-29
    3.1.4 家蚕lipase家族以及其他物种lipase部分成员的进化分析  29
    3.1.5 家蚕lipase-1与其他物种的同源性比较  29
    3.1.6 家蚕基因芯片数据聚类处理  29
  3.2 结果与分析  29-34
    3.2.1 家蚕lipase家族成员鉴定  29-30
    3.2.2 家蚕lipase的序列分析及进化关系分析 #2l  30
    3.2.3 家蚕lipase基因与其他物种同源性比对  30-33
    3.2.4 家蚕lipase的表达特征分析  33-34
  3.3 讨论  34-36
第四章 Bmlipase1的转基因表达载体的构建  36-48
  4.1 材料与方法  36-46
    4.1.1 基因克隆中需要的试剂和仪器  36-38
    4.1.2 主要溶液及配制  38-40
    4.1.3 RNA的提取  40-41
    4.1.4 RNA的检测  41
    4.1.5 cDNA制备及检测  41-42
    4.1.6 分子克隆  42-44
    4.1.7 载体构建方法  44-46
  4.2 结果与分析  46-47
  4.3 讨论  47-48
第五章转基因注射及阳性个体筛选与分子检测  48-62
  5.1 材料与方法  48-55
    5.1.1 材料的培育  48
    5.1.2 显微注射  48
    5.1.3 转基因阳性个体筛选  48
    5.1.4 southern杂交检测  48-52
    5.1.5 反向PCR方法  52-53
    5.1.6 半定量与荧光定量PCR检测方法  53-55
  5.2 结果与分析  55-59
    5.2.1 阳性个体的筛选和选育  55-57
    5.2.2 southern杂交结果  57
    5.2.3 转基因插入位点分析  57-58
    5.2.4 半定量检测  58
    5.2.5 定量PCR  58-59
  5.3 讨论  59-62
第六章增量表达Bmlipase-1的转基因株系的病毒抗性检测  62-70
  6.1 材料与方法  62-64
    6.1.1 攻毒材料的培育  62
    6.1.2 半致死剂量的计算  62-63
    6.1.3 攻毒试验设计  63
    6.1.4 攻毒后材料的提取  63
    6.1.5 统计学分析  63-64
  6.2 结果与分析  64-67
    6.2.1 攻毒统计分析  64-66
    6.2.2 攻毒后的半定量PCR检测  66
    6.2.3 攻毒后的定量PCR检测  66-67
  6.3 讨论  67-70
第七章小结  70-72
参考文献  72-78
在读期间发表论文及参研课题情况  78-80
附录  80-82
致谢  82

增量表达抗病毒蛋白Bmlipase-1的家蚕转基因系统的建立

内容摘要

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