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家蚕（Bombyx mori）piggyBac转座子转基因载体的构建及转基因方法的研究

作　者: 王宇
导　师: 李维
学　校: 四川师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 家蚕转座子piggyBac 丝心蛋白轻链基因转基因
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

家蚕(Bombyx mori)是一类重要的经济昆虫,目前作为生物反应器表达了多种外源蛋白,特别是其丝腺能够产生大量的丝蛋白,而成为研究的热点。但还存在许多不足,如外源基因的有效导入、整合、表达及转基因个体遗传稳定性等问题,仍需进一步深入研究。首先,本研究构建了基于转座子piggyBac的表达载体和辅助质粒。将家蚕细胞质肌动蛋白基因BmA3(cytoplasmic actinBmA3)启动子(不含信号肽序列)与转座子piggyBac的转座酶编码区融合构建成辅助质粒(pARTR1.2);将BmA3启动子(含信号肽序列和部分编码区)与绿色荧光蛋白基因(gfp)融合,插入到人工合成的转座子piggyBac两反向末端序列间,进而构建成基于转座子piggyBac的转基因载体(pZAGFP),在此载体中设计了一个多克隆位点区,便于外源基因的插入。其次,从家蚕(Bombyx mori)品种菁松×皓月后部丝腺中提取总RNA,用RT-PCR扩增技术克隆到家蚕丝心蛋白轻链cDNA,序列分析表明,该片段全长为798个碱基。比较4种不同品种来源的家蚕丝心蛋白轻链基因外显子区域序列,同源性在98.0%-99.4%之间,推测的氨基酸同源性在98.0%-99.6%之间,四个品种间发生的变异比较一致地集中在不同位置的8个碱基上。提取家蚕品种菁松×皓月后部丝腺总DNA,利用PCR扩增技术获得家蚕丝心蛋白轻链基因调控片段和终止子片段,长度分别约为1.2 kb和0.45kb,分别与J-139 L链基因相应区域进行比对,同源性高达98.8%和99%。结果表明,启动子片段包含一些典型的调控元件和多个可能参与

全文目录

文献综述  13-33
  1 家蚕丝蛋白及其基因结构的研究  13-16
    1.1 家蚕丝心蛋白重链（fib-H）  13-15
      1.1.1 丝心蛋白重链的结构  13-14
      1.1.2 丝心蛋白重链基因的结构  14-15
    1.2 家蚕丝心蛋白轻链（fib-L）  15
    1.3 丝蛋白P25  15
    1.4 L 链和H链的连接在丝心蛋白生物合成中的作用  15-16
  2 丝蛋白基因的表达调控研究  16-17
    2.1 丝蛋白基因的上游调控区域  16
    2.2 参与调控丝蛋白基因表达的影响因素  16-17
  3 转基因家蚕的研究进展  17-27
    3.1 外源基因导入蚕的方法  18-23
      3.1.1 显微注射法  18-19
      3.1.2 精子介导法  19-21
      3.1.3 脂质体法  21
      3.1.4 电穿孔法  21
      3.1.5 脉冲场电泳法  21-22
      3.1.6 基因枪法  22
      3.1.7 病毒介导法  22-23
    3.2 外源基因在家蚕基因组中的整合与表达  23-25
      3.2.1 外源基因在家蚕基因组中的整合  23-24
      3.2.2 影响外源基因表达的因素  24-25
    3.3 转基因研究中所用的报告基因及检测方式  25-27
  4 展望  27
  参考文献  27-33
第一章家蚕（Bombyx mori）胞质肌动蛋白基因启动子的克隆及piggyBac 转座子表达载体的构建  33-51
  摘要  33-34
  1材料和方法  34-40
    1.1 实验材料  34-36
      1.1.1 动物材料  34
      1.1.2 菌种和质粒  34
      1.1.3 酶和试剂  34
      1.1.4 培养基  34-35
      1.1.5 常用试剂配制  35-36
      1.1.6 主要仪器设备  36
    1.2 实验方法  36-40
      1.2.1 家蚕后部丝腺基因组DNA的提取  37
      1.2.2 引物的设计合成  37
      1.2.3 PCR扩增体系  37-38
      1.2.4 PCR 产物的回收  38
      1.2.5 DNA 片段的分离及纯化  38-39
      1.2.6 质粒DNA转化  39-40
        1.2.6.1 感受态细胞的制备  39
        1.2.6.2 质粒DNA的转化  39-40
      1.2.7 质粒DNA提取  40
      1.2.8 限制性内切酶反应  40
      1.2.9 DNA连接反应  40
      1.2.10 DNA序列的测定和分析  40
  2 结果与讨论  40-48
    2.1 细胞质肌动蛋白基因启动子的克隆及序列分析  40-43
    2.2 辅助质粒的构建  43-45
    2.3 转座子转基因表达载体的构建  45-48
      2.3.1 中间载体pZGFPN的构建  45-46
      2.3.2 表达质粒pZAGFP 的构建  46-48
  3 小结  48-49
  参考文献  49-51
第二章家蚕（Bombyx mori）丝心蛋白轻链ｃＤＮＡ、基因调控片段和终止子的克隆及序列分析  51-64
  摘要  51-52
  1 材料和方法  52-56
    1.1 实验材料  52-53
      1.1.1 家蚕（Bombyxmori）品种  52
      1.1.2 菌种和质粒  52
      1.1.3 工具酶和生化试剂  52
      1.1.4 培养基  52
      1.1.5 常用试剂配制  52-53
    1.2 实验方法  53-56
      1.2.1 家蚕后部丝腺总RNA的提取  53
      1.2.2 RNA 甲醛变性凝胶电泳  53-54
        1.2.2.1 制胶  53-54
        1.2.2.2 样品处理  54
        1.2.2.3 电泳  54
        1.2.2.4 染色  54
      1.2.3 引物的设计合成  54-55
      1.2.4 RT–PCR扩增L-cDNA  55-56
  2 结果  56-57
    2.1 RT-PCR合成并克隆家蚕丝心蛋白轻链cDNA  56
    2.2 PCR合成并克隆家蚕丝心蛋白轻链基因调控片段和终止子片段  56-57
  3 讨论  57-61
    3.1 家蚕L 链cDNA的序列分析  57-60
    3.2 家蚕丝心蛋白轻链基因调控片段的序列分析  60-61
    3.3 家蚕丝心蛋白轻链基因终止子的序列分析  61
  4 小结  61-62
  参考文献  62-64
第三章家蚕（Bombyx mori）转基因方法的初步研究  64-73
  摘要  64-65
  1材料和方法  65-68
    1.1 实验材料  65
      1.1.1 动物材料  65
      1.1.2 菌种和质粒  65
      1.1.3 酶和试剂  65
      1.1.4 引物的设计与合成  65
      1.1.5 培养基和常用试剂  65
    1.2 方法  65-68
      1.2.1 PCR 扩增检测  65-66
      1.2.2 显微注射法  66-67
        1.2.2.1 钨针、显微注射针制备  66
        1.2.2.2 上液  66
        1.2.2.3 蚕卵的预处理和显微注射  66-67
      1.2.3 精子介导法  67
      1.2.4 脂质体法  67-68
        1.2.4.1 注射针的制备  67-68
        1.2.4.2 注射  68
      1.2.5 压力渗透法  68
      1.2.6 家蚕基因组DNA的提取  68
  2 结果和讨论  68-71
    2.1 外源基因的导入  68-70
    2.2 转基因载体有效性的研究  70-71
  3 小结  71-72
  参考文献  72-73
附图一家蚕细胞质肌动蛋白A3 基因启动子反向测序图  73-74
附图二家蚕丝心蛋白轻链基因启动子反向测序图  74-75
附图三家蚕丝心蛋白轻链cDNA 反向测序图  75-76
附图四家蚕丝心蛋白轻链基因终止子反向测序图  76-77
硕士研究生期间发表的论文  77-78
致谢  78

家蚕（Bombyx mori）piggyBac转座子转基因载体的构建及转基因方法的研究

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